黃國(guó)珍 陳偉布 李麗梅 黃新民

1.深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518118；2.深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001

黏附于動(dòng)物腸道內(nèi)最主要的細(xì)菌就是雙歧桿菌。雙歧桿菌是機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)菌，它們的存在對(duì)維持機(jī)體腸道內(nèi)菌種生態(tài)平衡有重要的促進(jìn)作用。脂磷壁酸是革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁內(nèi)的重要大分子。有研究表明，脂磷壁酸能結(jié)合至巨噬細(xì)胞表面，激活巨噬細(xì)胞許多信號(hào)通路，分泌許多重要細(xì)胞因子[1]，從而對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力產(chǎn)生促進(jìn)作用[2]。本研究探討了雙歧桿菌的脂磷壁酸對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

7～10 周齡的Bal/c小鼠20只，其中，雄性10只，雌性10只，體重20～25 g。人體淋巴癌細(xì)胞傳代于100 ml的胎牛血清培養(yǎng)液中，當(dāng)它們貼壁生長(zhǎng)成單層時(shí)，用胰蛋白酶消化[3]。TNF-α檢測(cè)試劑盒為Sigma公司生產(chǎn)，細(xì)胞裂解液購(gòu)自Bio-Rad公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自Signalling公司。

1.2 方法

1.2.1 脂磷壁酸的提取 將雙歧桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，在 37℃無(wú)氧環(huán)境中培養(yǎng) 48 h。用離心機(jī)（12 000×g，15 min）收集細(xì)菌。將細(xì)菌置入裂解液中，裂解10min，離心機(jī)（12000×g，15 min）收集上清液。將上清液置入50℃的水浴鍋中水浴20 min，當(dāng)溶液分成上下兩層時(shí)，結(jié)束水浴。將上層溶液放入陰離子層析器中，再用醋酸銨緩沖溶液洗脫，此時(shí)脂磷壁酸吸附在洗脫柱上。將脂磷壁酸溶于緩沖液中，用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)明顯的核酸和蛋白質(zhì)污染時(shí)，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[4]。

1.2.2 具體方法 將20只小鼠隨機(jī)分成脂磷壁酸組（10只）和對(duì)照組（10只）。兩組小鼠的性別、體重等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。脂磷壁酸組小鼠每天空腹注射脂磷壁酸溶液（10 g/L）3 ml，對(duì)照組小鼠每天空腹注射緩沖溶液3 ml，兩組均連續(xù)注射10 d。

1.2.3 巨噬細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 10 d后將20只小鼠全部處死，提取小鼠腹腔液，用離心機(jī)（12 000×g，5 min）離心，收集沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)于胎牛血清培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)48 h后，測(cè)定TNF-α活性。

1.2.4 TNF-α活性的測(cè)定 根據(jù)Giffords的方法，在培養(yǎng)板上加入小鼠的TNF-α作陽(yáng)性對(duì)照，確定小鼠TNF-α活性單位數(shù)（U/ml），并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，兩組間的相互比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

脂磷壁酸組小鼠的 TNF-α 為（78.45±34.21）U/ml；而對(duì)照組小鼠的 TNF-α 為（34.54±13.45）U/ml。 兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.18＞1.86，P＜0.05）。

3 討論

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[5]，脂多糖能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。TNF-α有許多生物學(xué)活性，能抑制和殺死腫瘤細(xì)胞。在機(jī)體內(nèi)外TNF-α均能殺死許多腫瘤細(xì)胞，也能抑制腫瘤細(xì)胞的增生。不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性有很大的差異，甚至TNF-α能對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有刺激增生作用。目前對(duì)TNF-α殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制還不甚清楚，主要的觀點(diǎn)如下。①直接殺死腫瘤細(xì)胞：TNF-α與靶細(xì)胞受體結(jié)合后，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，與溶酶體結(jié)合，破壞溶酶體，使溶酶體穩(wěn)定性降低，使各種酶外泄，導(dǎo)致細(xì)胞裂解。②調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能：促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。③作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞：使內(nèi)皮細(xì)胞的血管功能紊亂，形成血栓，導(dǎo)致腫瘤組織血流供應(yīng)阻斷，使之缺氧而死[6]。④使細(xì)胞增殖：T細(xì)胞NHCⅠ類抗原表達(dá)是依靠TNF-α來(lái)促進(jìn)的，TNF-α能增強(qiáng)T細(xì)胞增殖能力，使T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如CSF淋巴因子；TNF-α也能增強(qiáng)刺激B細(xì)胞的增殖，促使B細(xì)胞分泌Ig；對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞，TNF-α具有生長(zhǎng)因子樣作用[7]，與胰島素等一同促進(jìn)細(xì)胞的增殖。⑤促進(jìn)原癌基因表達(dá)：TNF-α也能促進(jìn)原癌基因的表達(dá)（如c-Fos），這些原癌基因能促進(jìn)細(xì)胞的增值，使細(xì)胞周期快速轉(zhuǎn)變。

只有TNF-α有活性才能行使生物學(xué)功能，目前研究比較多的是脂磷壁酸激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。有研究發(fā)現(xiàn)，將脂磷壁酸注射到腫瘤小鼠的腹腔內(nèi)，能抑制小鼠體內(nèi)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生命，而未注射脂磷壁酸的腫瘤小鼠死亡較快。對(duì)小鼠血清進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，注射過(guò)脂磷壁酸的腫瘤小鼠TNF-α含量較未注射脂磷壁酸者要高，提示脂磷壁酸可能激活了巨噬細(xì)胞，促使其分泌大量的TNF-α來(lái)抵抗腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。目前對(duì)脂磷壁酸激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的機(jī)制解釋如下：巨噬細(xì)胞表面可能有脂磷壁酸的受體，脂磷壁酸能識(shí)別這些受體，吸附在巨噬細(xì)胞上，導(dǎo)致細(xì)胞表面第二信號(hào)的傳遞，第二信號(hào)受體（如PKA蛋白）進(jìn)入細(xì)胞核激活TNF-α基因轉(zhuǎn)錄蛋白，從而使TNF-α基因開始轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生TNF-α。TNF-α再進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌到巨噬細(xì)胞外，行使抗腫瘤作用。

通過(guò)本研究，證明了雙歧桿菌的脂磷壁酸確實(shí)能激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，從而為臨床治療提供了依據(jù)。

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