聶績 周穎琳張新祥

(北京大學化學與分子工程學院 北京100871)

1982年，Cech等［1］發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的I型內(nèi)含子剪切與外顯子拼接過程無需任何蛋白質(zhì)存在，這打破了酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)的概念，證明了RNA具有酶的催化功能。1983年，Altman等［2］在研究核糖核酸酶P時發(fā)現(xiàn)具有切割核糖體RNA前體功能的RNA，并證明其具有全酶活性。因為核酶(ribozyme)的發(fā)現(xiàn)，Cech和Altman共享了1989年諾貝爾化學獎。1994年，Breaker和Joyce等［3］利用體外定向分子進化技術(shù)篩選得到第一條人工合成的具有切割磷酸二酯鍵功能的單鏈DNA，這種具有酶催化功能的DNA就叫做脫氧核酶(deoxyribozyme或DNAzyme)。核酶與脫氧核酶構(gòu)成了功能核酸的重要部分，核酶包括天然與人工合成核酶;但至少目前為止，自然界沒有發(fā)現(xiàn)天然脫氧核酶。人工合成的脫氧核酶迄今已有100多種［4］，由于其結(jié)構(gòu)與功能的多樣性，廣泛應用于基因治療、核酸分析、傳感器構(gòu)建等領(lǐng)域。

1 脫氧核酶基本概念

脫氧核酶的化學本質(zhì)是DNA。相較于RNA而言，脫氧核酶缺少呋喃糖環(huán)2-OH，這決定了脫氧核酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強于以RNA成構(gòu)的核酶。所有脫氧核酶均為單鏈，同RNA相似，可以形成復雜多樣的折疊結(jié)構(gòu)并顯示出催化功能。脫氧核酶可以催化多類反應，如RNA或DNA切割、DNA連接、DNA水解等［5］。與傳統(tǒng)的蛋白酶相比，脫氧核酶具有穩(wěn)定性高，相對分子質(zhì)量小，易化學合成、修飾與復制，受pH等環(huán)境因素影響小等優(yōu)勢。脫氧核酶非常容易進行以核酸為識別模式或者信號表達模式的傳感器構(gòu)建;另外，脫氧核酶具有對DNA進行連接與斷裂的催化能力，可以應用到基因調(diào)控與治療中。

各種功能多樣性的脫氧核酶可通過合理設(shè)計不同的體外篩選方式獲得。篩選過程往往是從一個固相化學合成的DNA隨機文庫出發(fā)，通過合理設(shè)計，將能夠催化與不具備催化能力的寡核苷酸序列區(qū)分開;再利用聚合酶鏈式反應(PCR)，對具有催化能力的序列進行擴增，擴增后獲得一個新的文庫并應用于下一輪篩選。文庫中特異性序列純度隨循環(huán)篩選過程進行而增加，直至達到較高催化活力水平時結(jié)束篩選。完成篩選后，需要對獲得的序列進行表征以及效應評價。一般來說，在體外篩選過程中，需要進行反向篩選，以有效消除沒有催化活性的“寄生序列”;也可結(jié)合突變與修飾輔助重新篩選提高酶活性。也就是說，應針對不同的篩選目的，合理設(shè)計與優(yōu)化篩選方式。

脫氧核酶的催化功能特性改變了核酸僅僅是編碼以及遺傳信息攜帶者的觀念。目前，在分子生物學以及基因工程上，脫氧核酶主要是作為一種工具酶存在［6］。脫氧核酶可以在細胞水平上敲除某特異性基因，通過觀察該敲除基因?qū)τ诩毎磉^程中的作用，可以探明其功能。此外，利用脫氧核酶能特異性切斷信使RNA，可建立信使RNA水平上有效的基因滅活。通過調(diào)控蛋白質(zhì)表達阻斷基因表達，可實現(xiàn)對于某些生理、代謝途徑的調(diào)節(jié)調(diào)制。例如，10-23脫氧核酶被用于切斷人c-mycmRNA的起始密碼子A·UG位點［7］。本文將重點介紹脫氧核酶在傳感器領(lǐng)域的應用，其中主要涉及RNA切割型和G-四聚體型。

2 基于脫氧核酶的傳感器

傳感器是一種對物理或化學信息響應并產(chǎn)生可檢測信號的設(shè)備。其包括靶標識別與信號轉(zhuǎn)換兩個部分:靶標識別元件的作用是識別靶標，必須具備響應迅速、動態(tài)范圍寬、特異性高、穩(wěn)定性好以及普適性高的特點;信號轉(zhuǎn)換元件則是將識別事件轉(zhuǎn)換為信號，且信號與靶標濃度之間具有一定的定量關(guān)系。通常信號轉(zhuǎn)換元件可以將靶標識別轉(zhuǎn)化為熒光、比色、發(fā)光、電化學信號等。功能核酸包括核酶、脫氧核酶、核酸適體以及適體核酶，其靶標范圍非常廣泛，涉及金屬離子、有機小分子、生物大分子甚至細胞與病毒等。正由于可以特異性識別大量靶標，功能核酸已經(jīng)成為構(gòu)建靶標識別元件的重要平臺［8］。

脫氧核酶在生物基質(zhì)中比核酶更穩(wěn)定，且一般尺寸更小，可控性更強，價格便宜且易于合成。因此，目前較廣泛研究的是脫氧核酶構(gòu)建的傳感器。構(gòu)建方式主要是利用靶分子作為輔因子能夠促進脫氧核酶切斷RNA的反應，從而實現(xiàn)對靶分子(金屬離子或者氨基酸等)的定量檢測。另一方面，具有過氧化物酶活性的脫氧核酶可以用作識別元件本身或者構(gòu)建信號轉(zhuǎn)導元件。下面對這兩類脫氧核酶傳感器作詳細闡述。

2.1 RNA切割型脫氧核酶傳感器

具有RNA切割功能的脫氧核酶往往需要金屬離子或氨基酸等輔因子參與，但也存在無需任何輔因子的RNA切斷。10-23型脫氧核酶和8-17型脫氧核酶是兩種典型的RNA切割型脫氧核酶，可分別切割嘌呤-嘧啶連接以及AG連接。金屬離子的存在可促進DNA的正確折疊以及中間過渡態(tài)的穩(wěn)定，形成催化中心并具有催化活性。此外，還可以屏蔽寡核苷酸的負電荷，以利于酶鏈與底物鏈的趨近與結(jié)合。目前已發(fā)現(xiàn)Pb2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等離子依賴的RNA切割型脫氧核酶。如圖1所示為8-17E Pb2+特異性切割脫氧核酶，Pb2+存在下，可在底物鏈rA位點進行有效切割。目前利用RNA切割型脫氧核酶構(gòu)建的傳感器主要用于檢測輔因子，根據(jù)信號轉(zhuǎn)導方式不同主要分為熒光型、比色型以及電化學型。

圖1 8-17E Pb2+特異性切割脫氧核酶結(jié)構(gòu)示意圖

2.1.1 熒光型

分子信標(molecular beacon)是利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)與靶分子相互作用，使末端標記的熒光基團(F)與猝滅基團(Q)由靠近變?yōu)橄嗷ミh離，從而使熒光信號增強(圖2(A))。脫氧核酶切割反應過程類似于分子信標的原理，被稱為催化信標。在脫氧核酶催化信標中，可以通過靈活地選取合適的標記位點(圖2(B～G))設(shè)計不同類型的標記型熒光傳感器。Lu等［9］在底物鏈與酶鏈末端分別標記熒光基團與猝滅基團(圖2(C))，利用底物鏈斷裂導致的熒光增強，可實現(xiàn)Pb2+1×10-8～4×10-6mol/L的定量檢測。由于溫度升高會造成雜交雙鏈解離，導致熒光背景增加，因此該實驗選擇在4℃操作。Lu等［10］在以上工作基礎(chǔ)上，在底物鏈的另一端標記猝滅基團(圖2(D))，使得即使發(fā)生雙鏈解離也不會有熒光背景信號的顯著提升。該方法借助分子內(nèi)及分子間猝滅，可有效降低背景，且不受檢測溫度的限制。該模型也被成功用于檢測、Cu2+［11-12］。為了獲得更好的猝滅效率，也有將猝滅基團與熒光基團標記在切割位點附近的方式(圖2(E～F))［13-14］。由于靠近切割位點的基團標記會影響催化過程，所以在構(gòu)建該類型熒光傳感器模型時需要進行系統(tǒng)優(yōu)化［15］。若將脫氧核酶一端固定在固相載體上(圖2(G))，通過洗滌可有效降低背景，Pb2+檢測限可以達到1×10-9mol/L，比均相溶液降低了一個數(shù)量級;同時，固定化酶鏈有利于傳感器的再生與重復使用［16］。

圖2 標記型熒光脫氧核酶傳感器示意圖［8］

一些先進的碳材料也被用于脫氧核酶熒光傳感器的構(gòu)建。Dordick等［17］將脫氧核酶與多壁碳納米管進行連接，獲得了高效穩(wěn)定的復合物。在底物鏈一端標記熒光基團可進行脫氧核酶催化能力的評估。Zhang等［18］利用石墨烯與單鏈DNA具有高親和作用且能夠猝滅熒光素的熒光，構(gòu)建了基于石墨烯-脫氧核酶的熒光增強型傳感器以檢測Pb2+，檢測限達3×10-10mol/L。

相對于標記型熒光傳感器而言，非標記型的普適性更強，不會因為基團標記影響酶催化切割過程。脫氧核酶的無堿基位點能結(jié)合外源熒光基團2-氨基-5，6，7-三甲基-1，8-萘啶(ATMND)，同時猝滅其熒光。在Pb2+存在下，脫氧核酶對底物鏈產(chǎn)生切割作用，釋放出ATMND，使熒光恢復。Lu等［19］通過引入無堿基位點，建立了一種新型的無標記檢測Pb2+的方法，檢測限達到4×10-9mol/L。Wang等［20］利用嵌入式熒光染料picogreen(PG)與雙鏈DNA結(jié)合后熒光大大增強的性質(zhì)，構(gòu)建了非標記檢測Pb2+的方法。該方法簡單、免修飾、成本低，檢測限達1×10-8mol/L(圖3)。具有光學性質(zhì)的高分子材料也被應用到傳感器的構(gòu)建中，Hu等［21］利用水溶性陽離子聚乙烯(PT)與單雙鏈DNA結(jié)合表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)，設(shè)計非標記Pb2+切割型脫氧核酶傳感器，檢出限達到1×10-8mol/L。

2.1.2 比色型

比色型傳感器是利用顏色變化來傳導信號。核酸本身沒有顏色信號，所以構(gòu)建比色型脫氧核酶傳感器必須要引入信號探針。金納米顆粒是一種常用的具有高吸光系數(shù)的比色探針，其表面等離子體效應與自身粒徑大小及顆粒之間距離有關(guān)。處于分散狀態(tài)的金納米顆粒團聚后，吸收峰值將會從530nm移至650nm，溶液由紅變紫(甚至變藍)。目前基于金納米顆粒發(fā)展的比色型脫氧核酶傳感器主要是利用金納米顆粒之間通過雙鏈DNA連接以及單雙鏈DNA對金納米顆粒的穩(wěn)定效果的差異這兩種類型進行。

圖3 利用PG嵌入型熒光染料的非標記熒光法示意圖［20］

Lu等［22］將5'端標記巰基的具有12個堿基的DNA序列修飾于金納米顆粒表面。脫氧核酶底物鏈兩段延伸并能夠和修飾的DNA序列互補配對，形成雜交。當Pb2+存在時，底物鏈被切割，導致金納米顆粒分散，溶液呈紅色;當Pb2+不存在時，底物鏈與酶鏈和修飾DNA序列之間形成穩(wěn)定雜交，金納米顆粒被團聚在一起，溶液呈藍色。因此，利用比色法可以實現(xiàn)對Pb2+的定量檢測。切割位點附近的G·T搖擺鍵對于脫氧核酶17E的活性非常重要，如果將G·T更換為GC，即得到一個突變的脫氧核酶，命名為17Ec。17Ec在Pb2+輔助下完全不具有RNA切割功能。通過調(diào)節(jié)17E及17Ec的比例，就可以對Pb2+的檢測范圍實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控。Lu等［23］對該體系條件進行了摸索與優(yōu)化。由于所設(shè)計的體系需要較長時間才能觀察到顏色變化，Lu等［24］采取tail-to-tail連接方式代替head-to-tail模式(圖4)，用42nm的金納米顆粒代替13nm金納米顆粒，通過上述改進可在10min內(nèi)完成檢測。在以上體系中，存在Pb2+時，溶液顏色不發(fā)生變化;而沒有Pb2+時變?yōu)樗{色，屬于light-down型傳感器。為了設(shè)計light-up型傳感器(即存在Pb2+時顏色發(fā)生變化)，Lu等［25］采用tail-to-tail型連接，并添加與切斷后序列互補的DNA鏈，可以實現(xiàn)快速light-up檢測。更進一步，Lu等［26］將脫氧核酶左右兩側(cè)與底物連接臂部分設(shè)計為非對稱形式，避免了互補序列DNA鏈的使用。上述方法也被應用到對UO2+2特異性切割的脫氧核酶中，對放射性離子進行檢測［27］。

相較于峨眉、昆侖等其他門派對魔教的敵視，武當對于魔教的態(tài)度似乎有些模棱兩可。理智上他們覺得魔教行事詭譎，不為道義所容，如張翠山在初識殷素素時就曾因她是天鷹教弟子而抗拒與其交往。但情感上他們卻又能無視對方的身份，對所接受的人付出真心，如張翠山帶殷素素回武當時，師門也對他們表示祝福，并且盡力維護。

圖4 Lu等采用的head-to-tail及tail-to-tail組裝方式示意圖

單鏈DNA能夠在三羥甲基氨基甲烷與NaCl調(diào)節(jié)離子強度的環(huán)境中穩(wěn)定金納米顆粒，阻止紅色的金納米顆粒在高離子強度環(huán)境中形成藍色聚集體。對于Pb2+特異性切割脫氧核酶而言，在Pb2+存在時，底物鏈被切割為單鏈DNA，可以穩(wěn)定金納米顆粒;無Pb2+時，底物鏈與酶鏈之間形成穩(wěn)定雙鏈雜交，不能穩(wěn)定金納米顆粒，溶液變?yōu)樗{色聚集體。Lu課題組［28］及Wang課題組［29］基于此原理發(fā)展了檢測Pb2+的非標記比色型傳感器，檢出限可低至3×10-9mol/L(圖5)。

2.1.3 電化學型

圖5 基于金納米顆粒的非標記Pb2+比色傳感器工作原理示意圖［28］

與熒光和比色方法相比，電化學方法具有響應迅速、試劑消耗少、靈敏度高等特點。目前發(fā)展的電化學型脫氧核酶傳感器還比較少。Plaxco等［30］將酶鏈一端標記亞甲基藍基團，另一端通過Au—S鍵固定到金電極表面(圖6)。酶鏈與底物鏈雜交為雙鏈DNA，使結(jié)構(gòu)剛性增強，亞甲基藍遠離電極，從而使電子傳遞速率降低。當Pb2+存在時，底物鏈被切割釋放，酶鏈再度呈單鏈DNA狀態(tài)，電子傳遞速率增強。該方法首次將脫氧核酶修飾于電極表面，未出現(xiàn)酶活性喪失，Pb2+檢出限達3×10-7mol/L。Shao等［31］采用帶正電荷的六氨合釕與帶負電荷的脫氧核酸鏈骨架靜電相互結(jié)合作為信號轉(zhuǎn)換元件，DNA-Au生物條形碼作信號放大，發(fā)展了基于Pb2+特異性切割脫氧核酶的電化學傳感器。當Pb2+存在時，被切斷的底物鏈與DNA-Au生物條形碼被釋放，電極表面六氨合釕減少，其電化學信號降低。由于生物條形碼的放大作用，該方法檢出限可達1×10-9mol/L。以上方法均具有普適性，可用于其他離子特異性脫氧核酶傳感器的構(gòu)建。同樣利用金納米顆粒，Tian等［32］將脫氧核酶鏈固定于金納米顆粒表面，再與底物鏈雜交。Pb2+切割后，底物鏈釋放，再度呈單鏈狀態(tài)的酶鏈可與固定于電極表面的互補鏈雜交，利用六氨合釕與脫氧核酸骨架作用獲取電信號。該方法極靈敏，檢測限可達2.8×10-11mol/L。

圖6 Plaxco等在電極表面固定Pb2+特異性切割脫氧核酶進行電化學檢測［30］

2.1.4 切割型脫氧核酶作為信號放大元件及構(gòu)建納米器件

切割型脫氧核酶不只是被應用于檢測輔因子，也作為信號放大或信號轉(zhuǎn)導的工具被應用于其他靶分子傳感器的構(gòu)建中。目前的研究主要是利用Mg2+特異性切割的脫氧核酶，建立了酶放大電化學檢測、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、比色等方法。

Yu等［33］設(shè)計了Mg2+特異性切割10-23型脫氧核酶作為識別探針。此識別探針可與靶序列以及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的底物鏈通過雜交作用形成特定構(gòu)象，在Mg2+作用下，底物鏈被切斷釋放，再由該解離的碎片底物鏈通過雜交捕獲于電極表面。由于捕獲的碎片底物鏈一端標記有生物素，可以通過親和素、生物素之間的特異性親和作用連接鏈霉親和素修飾的磷酸酯酶，即可催化氧化底物產(chǎn)生電化學響應。該方法對于靶標序列的檢測限可達5×10-14mol/L。

Willner等借助Mg2+特異性脫氧核酶自催化及分解的脫氧核酶中介過程實現(xiàn)對靶序列DNA的放大檢測［34］。此外，他們也利用自組裝脫氧核酶線的聚合物，實現(xiàn)對靶序列DNA分析的信號放大［35］。兩種放大模式都是建立在切斷兩端標記猝滅基團與熒光基團的底物鏈的基礎(chǔ)上。前一種模式是在靶序列DNA 1存在時，打開序列3發(fā)卡區(qū)域，序列1、2、3、4形成穩(wěn)定復合物。在Mg2+存在下，切斷底物鏈4，獲得熒光增強信號(圖7)。通過合理的序列設(shè)計，可以實現(xiàn)切斷與復合物形成的循環(huán)放大，檢出限可降低3個數(shù)量級。在后一種脫氧核酶納米線的放大過程中，使用兩種發(fā)卡功能結(jié)構(gòu)。靶序列打開其中一個發(fā)卡，激活兩種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的自動化交聯(lián)過程，這種方式獲得的高聚物DNA線中包括Mg2+特異性切割的脫氧核酶結(jié)構(gòu)。利用如圖7所示原理，可獲得放大的熒光信號，檢測限低至10-14mol/L。利用類似的原理，Willner等［36］將標記熒光基團與猝滅基團的底物鏈替換為能夠形成G-四聚體結(jié)構(gòu)的底物鏈，一旦發(fā)生切斷解離，釋放的序列在氯高血紅素(hemin)輔助下具有過氧化物酶催化活性，可以構(gòu)建比色型核酸適體傳感器或者DNA傳感器。

圖7 Willner等利用Mg2+特異性切割脫氧核酶進行信號放大基本原理圖［34］

此外，脫氧核酶也被用以構(gòu)建可自動行走的DNA納米器件［37］。將兩種不同金屬離子Pb2+與Mg2+的脫氧核酶整合在一起，設(shè)計出超分子脫氧核酶結(jié)構(gòu)的比色邏輯門［38］。切割型與G-四聚體型脫氧核酶(詳見2.2)在功能核酸納米材料領(lǐng)域占據(jù)了重要的地位。

2.2 G-四聚體脫氧核酶傳感器

G-四聚體脫氧核酶是一類研究非常熱門的脫氧核酶。20世紀90年代末，Sen等［39-40］首次報道了具有過氧化物酶催化活性的脫氧核酶。這種酶與hemin結(jié)合能顯著增強hemin催化氧化H2O2的能力。G-四聚體結(jié)構(gòu)是由富含G(鳥嘌呤)的脫氧核苷酸序列通過非共價作用形成的特殊高級結(jié)構(gòu)［41］。脫氧核酸堿基之間通常存在氫鍵相互作用，但這一般是指Waston-Crick堿基互補配對所涉及的A-T、G-C之間的氫鍵作用。富G序列可以通過鳥嘌呤堿基間的Hoogsteen堿基配對形成更加高級的結(jié)構(gòu)——G-四聚體結(jié)構(gòu)。G-四聚體結(jié)構(gòu)一般可以分為:單分子平行，單分子反平行，雙分子反平行，四分子平行(圖8)。G-四聚體結(jié)構(gòu)與hemin結(jié)合后表現(xiàn)出過氧化物酶催化活性，可催化氧化2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽或者3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺，應用于比色分析;可催化氧化魯米諾產(chǎn)生化學發(fā)光信號;也可采用電化學方法檢測過氧化氫的電催化。G-四聚體-hemin已被當做信號探針或者信號放大模式廣泛應用于傳感器的構(gòu)建。

2.2.1 G-四聚體-hemin作為信號報告元件

G-四聚體-hemin已被應用于K+、Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+等離子的檢測。K+具有合適的尺寸，能夠進入到G-四聚體結(jié)構(gòu)中，穩(wěn)定其構(gòu)型。G-四聚體結(jié)構(gòu)對K+的結(jié)合具有一定選擇性，在所有堿金屬離子中，K+表現(xiàn)出的穩(wěn)定能力最強，可由形成的具有過氧化物酶催化活性的脫氧核酶進行比色，實現(xiàn)對K+的定量檢測［42-43］。Hg2+的檢測主要是利用Hg2+能夠和兩個胸腺嘧啶形成穩(wěn)定的T-Hg-T結(jié)構(gòu)，通過合理的序列設(shè)計，利用T-Hg-T穩(wěn)定G-四聚體結(jié)構(gòu)［44］，或者抑制該結(jié)構(gòu)生成來檢測Hg2+［45］。檢測Ag+類似于Hg2+，利用Ag+能夠與兩個胞嘧啶形成C-Ag-C結(jié)構(gòu)，設(shè)計該結(jié)構(gòu)使其形成抑制［46］或者穩(wěn)定［47］具有催化能力的G-四聚體結(jié)構(gòu)，可以進行Ag+定量。Pb2+對G-四聚體結(jié)構(gòu)具有比K+更強的穩(wěn)定能力，由于Pb2+半徑稍小于K+，在Pb2+存在下的G-四聚體結(jié)構(gòu)更加緊湊，可降低與hemin的結(jié)合能力?；谏鲜鲈恚梢詷?gòu)建熒光型［48］、比色型或化學發(fā)光型［49］Pb2+傳感器。也有利用金屬離子特異性切割脫氧核酶與G-四聚體結(jié)構(gòu)整合，在切割后釋放G-四聚體序列，G-四聚體-hemin實現(xiàn)信號輸出以檢測金屬離子。例如Tan等［50］將Cu2+特異性切割脫氧核酶與G-四聚體結(jié)構(gòu)整合，在Cu2+存在時，對發(fā)卡結(jié)構(gòu)進行切割釋放出G-四聚體序列，再通過與hemin結(jié)合，實現(xiàn)比色法檢測Cu2+。

圖8 G-四聚體結(jié)構(gòu)

一些核酸適體在與靶分子結(jié)合后也能形成G-四聚體結(jié)構(gòu)，與hemin結(jié)合可以表現(xiàn)出過氧化物酶催化特性。Dong等［51］利用與凝血酶結(jié)合的核酸適體能夠在凝血酶、K+以及hemin存在下形成具有催化能力的復合物，進行凝血酶的比色檢測。若將hemin更換為一種鋅的卟啉化合物Zinc(Ⅱ)-ProtoporphyrinⅨ，形成的G-四聚體復合物可產(chǎn)生熒光信號。三磷酸腺苷的核酸適體也能與靶分子形成G-四聚體結(jié)構(gòu)，利用Zinc(Ⅱ)-ProtoporphyrinⅨ/G-四聚體結(jié)構(gòu)可進行三磷酸腺苷定量檢測［52］。

除了檢測與靶分子相互作用，G-四聚體-hemin也被作為信息報告元件用于DNA［53］、酶、單堿基多態(tài)性［54］等檢測，甚至開發(fā)出pH敏感的脫氧核酶納米結(jié)構(gòu)［55］。在作為傳感信號報告元件時，往往需要合理的序列設(shè)計。在目標事件(例如:與靶序列雜交，酶催化反應等)發(fā)生后引入或釋放出G-四聚體序列，并在hemin存在條件下折疊為具有催化活力的模擬酶結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生信號。目前，基于G-四聚體-hemin作為信號表達測定端粒酶［52-53］、甲基轉(zhuǎn)移酶［56］、限制性內(nèi)切酶［57］等的方法均有報道。這些傳感器的構(gòu)建將有利于研究酶的生理調(diào)制、抑制與激活作用。

2.2.2 G-四聚體-hemin結(jié)構(gòu)與核酸適體/脫氧核酶整合

利用G-四聚體-hemin作為信號報告元件與核酸適體或者脫氧核酶進行結(jié)合，拓寬了可檢測靶分子的類型，豐富了傳感器的設(shè)計模式。Willner等［58］將核酸適體與G-四聚體序列整合在一條鏈上，設(shè)計出能與其部分互補的序列。在有靶分子存在時，核酸適體與靶分子的相互作用破壞了兩條序列之間的結(jié)合，釋放的G-四聚體序列可與hemin結(jié)合折疊成具有過氧化物酶催化作用的G-四聚體-hemin結(jié)構(gòu)。該方法實現(xiàn)了小分子腺苷與大分子溶菌酶的檢測，檢出限分別為4×10-6mol/L及4×10-13mol/L。以上方法是基于兩條鏈而言，Willner等［59］在后續(xù)工作中還發(fā)展了只需要一條鏈的模式。如圖9所示，核酸適體與G-四聚體序列被設(shè)計為一個穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在沒有靶分子存在時，G-四聚體序列被幾個互補堿基封閉。當靶分子與核酸適體序列部分相互作用并改變構(gòu)型時，G-四聚體序列被釋放出來，可以產(chǎn)生模擬酶信號。Willner等［60］也在電極表面修飾發(fā)卡結(jié)構(gòu)或者引入互補鏈封閉G-四聚體序列，在靶分子存在時打開發(fā)卡釋放G-四聚體序列，利用G-四聚體-hemin產(chǎn)生的電信號檢測了葡萄糖氧化酶活性、目標DNA和腺苷。在Wang等［61］發(fā)展的檢測目標DNA以及靶分子的雙功能比色探針中，G-四聚體-hemin也被作為信號報告元件使用。兩個環(huán)結(jié)構(gòu)作為信號識別元件可特異性識別目標DNA與凝血酶，中間使用切斷為兩截的G-四聚體序列連接，以一種turn-off模式可分別檢測兩種靶標。

圖9 Willner組設(shè)計的核酸適體-G-四聚體序列發(fā)卡結(jié)構(gòu)工作原理［59］

除了與核酸適體相結(jié)合，G-四聚體-hemin也能夠與金屬離子特異性切割的脫氧核酶相結(jié)合，并作為檢測金屬離子或目標DNA的信號報告元件。Willner等［62］結(jié)合Pb2+特異性切割脫氧核酶與G-四聚體-hemin結(jié)構(gòu)發(fā)展了靈敏的表面等離子體共振(SPR)以及電化學檢測的方法。利用H2O2氧化還原性質(zhì)進行電化學檢測，檢測限達1×10-12mol/L;在SPR方法中，利用AuNPs與表面等離子體波電子耦合進行信號放大，檢測限可達5×10-15mol/L。Mg2+切割型脫氧核酶也與G-四聚體-hemin結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起，進行信號表達、放大以及納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建(詳見2.1.4)。

2.2.3 不同放大模式

G-四聚體-hemin結(jié)構(gòu)具有過氧化物酶活性，可作為信號報告及放大元件，并可結(jié)合納米材料或序列擴增等進行進一步放大，實現(xiàn)超靈敏檢測。Ju等［63］使用金納米顆粒表面修飾G-四聚體序列，加入hemin后形成G-四聚體-hemin功能化的金納米顆粒。利用該探針標記抗體，再輔助量子點與碳納米管可進行基于三明治夾心法免疫分析的電致化學發(fā)光檢測。模擬過氧化物酶功能化的金納米顆粒還可用于檢測目標DNA或者端粒酶活性的信號放大［53］。

滾環(huán)擴增是在DNA引物、環(huán)狀DNA模版以及DNA聚合酶作用下，擴增出含有重復序列單元的單鏈DNA。利用滾環(huán)擴增的方法可以實現(xiàn)對G-四聚體結(jié)構(gòu)的重復擴增，也就是說，使模擬酶數(shù)量增加。這相較于G-四聚體-hemin的催化放大而言，放大功能被進一步提升。Mao等［64］利用滾環(huán)擴增原位生成若干重復的G-四聚體序列，對目標DNA的串聯(lián)G-四聚體-hemin信號放大進行比色檢測，檢測限達1×10-12mol/L。Li等［65］以avidin修飾的磁珠為載體，用核酸適體對靶分子進行特異性識別。再利用滾環(huán)擴增延伸串聯(lián)G-四聚體結(jié)構(gòu)，進行過氧化物模擬酶催化與磁珠雙放大。該方法可在2小時內(nèi)實現(xiàn)對血小板衍生生長因子(PDGF)的檢測，檢出限為0.2ng/L。滾環(huán)擴增的方法雖然可實現(xiàn)超級放大以及超靈敏檢測，但其成功依賴于合理的序列設(shè)計。

Willner等［66］設(shè)計了含有3/4及1/4 G-四聚體模擬酶序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，作為檢測目標DNA的功能化信號放大元件。當目標DNA出現(xiàn)時，發(fā)卡被打開，引發(fā)自動化DNA納米線的組裝。得到的納米線包含許多G-四聚體結(jié)構(gòu)，可以在結(jié)合hemin后進行比色或化學發(fā)光的檢測。該方法是一種非酶(指蛋白酶)放大模式，檢測限可達10-13mol/L。自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計將對信號放大技術(shù)的發(fā)展提供更多的可選擇模式。

3 總結(jié)與展望

脫氧核酶相比于蛋白酶而言穩(wěn)定性好，相對分子質(zhì)量小，可控性強、便于與其他功能核酸進行序列設(shè)計與整合，既可作為識別元件又可作為信號轉(zhuǎn)導與放大元件，是構(gòu)建新型生物傳感器的有力工具。目前，已經(jīng)有很多研究小組對于脫氧核酶傳感器在分析化學領(lǐng)域的研究做了開創(chuàng)性的工作，但是，進一步拓寬及將其應用于臨床或?qū)嶋H檢測，還有很多問題需要解決:(1)目前應用于傳感器設(shè)計的脫氧核酶主要是應用金屬特異性切割以及卟啉金屬化模擬酶性質(zhì)的脫氧核酶，而將更多的，具有諸如連接、水解、激酶活性、戴帽活性以及針對于特定靶分子、靶反應的脫氧核酶應用到傳感器的構(gòu)建中，將大大拓展基于脫氧核酶傳感器的適用范圍與設(shè)計靈活性。(2)目前文獻報道的許多傳感器只是在實驗條件下進行概念驗證，沒有真正應用到實際樣品及生物體內(nèi)。事實上，實際生物樣品的復雜基質(zhì)將會在很大程度上影響傳感器的工作。在抗基質(zhì)干擾方面，還需要做更多的工作，以推進傳感器真正應用于臨床檢測。(3)適體核酶(由含有受體位點的核酸適體與含有催化位點的核酶或脫氧核酶組成)可以作為一種復雜的化學開關(guān)，在與靶分子識別作用時變構(gòu)激活或抑制催化反應。適體核酶的發(fā)展與推廣為傳感器設(shè)計、定量檢測、高通量篩選以及基因調(diào)控提供了新的思路。

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