王連栓，孫玉杰，張海林（.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 67000；2.云南省地方病防治所，云南大理 67000）

乙型肝炎病毒（HBV）是肝臟疾病的重要致病因子，是嚴(yán)重危害人類健康的病毒之一。目前，全世界HBV攜帶者約有3.8億，而我國約有1.5億人。HBV感染后臨床表現(xiàn)呈多樣性，可表現(xiàn)為無癥狀攜帶者、急性肝炎、重癥肝炎或慢性肝炎，其中部分慢性肝炎可演變?yōu)楦斡不蚋伟?。每年死于乙型肝炎相關(guān)性肝病約為50萬人。根據(jù)HBV全基因序列異質(zhì)性大于或等于8%的界線就可以定義為一個(gè)基因型標(biāo)準(zhǔn)，可將HBV分為A～H 8種基因型。但最近在日本和東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)了不同于以往核酸序列的新基因型：I型和J型[1－2]。有研究證據(jù)顯示肝病的轉(zhuǎn)歸，病情的進(jìn)展等都與HBV基因型相關(guān)。Kato等[3]和Kobayashi等[4]的研究結(jié)果表明B基因型常表現(xiàn)溫和的肝纖維化；C基因型易引起浸潤性的嚴(yán)重肝臟疾病，并發(fā)展成為肝硬化和肝癌；而且C型HBV對(duì)干擾素治療反應(yīng)不敏感。Chu等[5]研究顯示C型感染和肝炎復(fù)發(fā)也是發(fā)生肝硬化的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子。因此，早期、準(zhǔn)確的HBV基因分型對(duì)肝病的診斷、治療和病情的預(yù)測與轉(zhuǎn)歸有重要的指導(dǎo)意義。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是近幾年快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，已廣泛地應(yīng)用于病原學(xué)檢測、基因組研究領(lǐng)域。特別是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，為HBV基因型的檢測提供了有力的依據(jù)。為此作者對(duì)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測方法在HBV基因分型中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ－PCR）

FQ－PCR是一種實(shí)時(shí)定量分析技術(shù)，是利用TaqDNA聚合酶的5′－3′外切核酸酶活性，在擴(kuò)增的同時(shí)降解雜交于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的探針，使連接于雜交探針的熒光淬滅基團(tuán)和熒光發(fā)射基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光，因此熒光強(qiáng)度的變化能反映擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。由于在擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)中均由計(jì)算機(jī)同步跟蹤和直接探測擴(kuò)增過程中產(chǎn)物量的變化，不需做擴(kuò)增后產(chǎn)物的處理或檢測，克服了擴(kuò)增產(chǎn)物終點(diǎn)檢測所存在的“平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)產(chǎn)物定量的影響，減少了污染機(jī)會(huì)，因此本技術(shù)具有高度的特異性、靈敏度與準(zhǔn)確性。目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原體檢測、腫瘤免疫、基因表達(dá)、基因組變異等方面。潘克女等[6]，設(shè)計(jì)2條熒光探針，對(duì)240例HBV感染者采用FQ－PCR技術(shù)進(jìn)行基因型檢測。結(jié)果基因B型82例，基因C型140例，基因B/C混合型15例，未知3例。同時(shí)應(yīng)用全序列測序法對(duì)FQ－PCR檢測出的B型、C型基因標(biāo)本各10例進(jìn)行檢測驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)與實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測完全一致。由此認(rèn)為FQ－PCR結(jié)果判斷比較簡單、省時(shí)、可靠，適合HBV基因型的流行病學(xué)調(diào)查。蔣新良[7]對(duì)36例乙型肝炎患者的血清分別采用熒光定量PCR技術(shù)、測序技術(shù)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基因芯片技術(shù)進(jìn)行HBV基因型的檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光定量PCR技術(shù)特異性100%，敏感性83%，結(jié)論認(rèn)為該技術(shù)雖然是目前最常用的技術(shù)，但也存在每次檢測只能檢出一種基因型的缺點(diǎn)。為建立一種快速準(zhǔn)確的檢測HBV基因型方法，孫余婕等[8]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)150例乙肝患者進(jìn)行HBV－DNA定量檢測和分型檢測，并對(duì)其中的114例標(biāo)本進(jìn)行測序分型檢測以驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果HBV分型檢測與HBV－DNA測序檢測的114例樣本中，只要是HBV B基因型、C基因型或B/C混合型，HBV基因分型檢測都能檢出來（共111例），總體符合率為100%。未能被本法檢出的3例樣本經(jīng)測序分型均為D型。結(jié)論認(rèn)為應(yīng)用TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能快速對(duì)HBV基因型B基因型、C基因型進(jìn)行檢測，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，特異性高。

2 巢式PCR

此種技術(shù)與一般PCR的區(qū)別在于用兩對(duì)引物代替了1對(duì)引物對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。第1對(duì)PCR引物的擴(kuò)增與標(biāo)準(zhǔn)PCR十分相似。不過，第2對(duì)引物被稱為巢式引物的引物結(jié)合到第1輪PCR產(chǎn)物片段上后將引發(fā)第2輪的擴(kuò)增，只是產(chǎn)物比第1輪的短。巢式PCR的優(yōu)勢在于，如果在第1輪擴(kuò)增中出現(xiàn)了錯(cuò)誤的擴(kuò)增片段，在第2輪擴(kuò)增中它再次被擴(kuò)增的可能性非常小。因此該技術(shù)是一種特異性很強(qiáng)的PCR技術(shù)。Naito等[9]設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行巢式PCR。首先用共用引物擴(kuò)增S開放讀碼區(qū)，再用加入型特異性引物的混合物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出不同長度的核苷酸片段，成功地進(jìn)行了HBV基因型分型。殷繼明等[10]應(yīng)用巢式PCR法，設(shè)計(jì)10條內(nèi)外引物對(duì)276例HBV－DNA陽性標(biāo)本進(jìn)行基因分型檢測，結(jié)果HBV基因型總檢出率以C型為主，占76.8%，B型占21.7%，B和C混合型占1.5% ，未檢出 A、D、E、F基因型。結(jié)論認(rèn)為該方法簡便易行、敏感性和特異性高，可用于HBV感染的流行病學(xué)調(diào)查。張于勤和崔魴[11]應(yīng)用多對(duì)型特異性引物巢式PCR方法檢測15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型，結(jié)果通過兩輪PCR擴(kuò)增后能直觀地辨別出HBV的基因型，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有些血清樣品第1輪擴(kuò)增為陰性，但在第2輪呈陽性，表明此種技術(shù)的特異性較高，可減少假陰性和假陽性的發(fā)生。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)此種方法步驟較復(fù)雜，污染機(jī)會(huì)大，雖特異性高但無法避免出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。曹家麟等[12]應(yīng)用型特異性引物巢式PCR對(duì)202例HBV－DNA陽性的慢性HBV感染者檢測HBV的基因型，結(jié)果成功分型，B型37例，C型123例，B/C混合型41例，D型1例，并取B、C基因型的樣本各2份，D基因型的樣本1份進(jìn)行測序分析，結(jié)果與型特異性引物巢式PCR法一致，表明該方法特異性高。同時(shí)也指出雖然該法特異性沒有直接測序法高，但若能嚴(yán)格掌握實(shí)驗(yàn)條件也能獲得滿意結(jié)果。溫志立和譚德明[13]應(yīng)用多對(duì)型特異性引物巢式PCR方法檢測了220例湖南籍慢性乙型肝炎血清中的HBV基因型，并與目前常用的PCR－RFLP法進(jìn)行了比較，且同時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)以證實(shí)該方法的可靠性和準(zhǔn)確性，結(jié)果兩種檢測結(jié)果完全一致，重現(xiàn)率100%。因此結(jié)論認(rèn)為這種巢式PCR分型法能清晰直觀地辨別HBV基因型，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。賴輝等[14]用該方法對(duì)80例 HBV－DNA陽性慢性 HBV感染者血清進(jìn)行HBV基因分型，結(jié)果經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增后成功分型，B型64例，C型12例，B/C混合基因型4例。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該方法操作簡捷，只需進(jìn)行PCR和電泳，結(jié)果清晰直觀不易誤判，對(duì)混合基因型的檢測尤為有利。結(jié)論認(rèn)為這種基因分型方法準(zhǔn)確可靠，并有很高特異性。王林川等[15]為了建立一種適用于臨床的HBV基因分型的方法，根據(jù)HBV基因型（AH）前S1到S基因的保守序列設(shè)計(jì)12條內(nèi)外引物，應(yīng)用該方法對(duì)360例乙型肝炎患者血清進(jìn)行擴(kuò)增，分型成功348例。有5例樣本第1輪PCR為陰性，第2輪陽性，F(xiàn)Q－PCR測定HBV－DNA＜103copies/mL，經(jīng)巢式PCR2輪擴(kuò)增，最終判定為C基因型，提示對(duì)于HBV低濃度樣本，巢式PCR優(yōu)于FQPCR。因此認(rèn)為此法具有簡單快速、靈敏度高、特異性高的特點(diǎn)，適用于臨床HBV基因分型檢測。

3 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－RFLP）

PCR－RFLP基本原理是用PCR擴(kuò)增HBV的S基因，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，最后通過不同的電泳圖譜直接分型。此項(xiàng)技術(shù)不需對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行雜交和測序，方法簡便，分型時(shí)間短。國內(nèi)彭亮和丁靜娟[16]對(duì)149份乙肝患者血清用PCR－RFLP分型方法進(jìn)行基因分型，并與多引物對(duì)PCR基因分型方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCRRFLP方法不僅在分型成功率、敏感度均優(yōu)于后者，而且操作步驟簡單，減少了污染機(jī)會(huì) ，能夠迅速準(zhǔn)確地進(jìn)行A－F各基因型分型，特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于大樣本篩檢及臨床應(yīng)用。為了驗(yàn)證PCR－RFLP方法在基因型分型中的準(zhǔn)確性，閻麗等[17]用此方法鑒定驗(yàn)證30例經(jīng)SPCR－PFLP方法已鑒定出的HBV B、C和D基因型標(biāo)本，并隨機(jī)其中各3株標(biāo)本進(jìn)行S基因測序證實(shí)。結(jié)果兩種HBV基因型分型結(jié)果一致。由此認(rèn)為PCR－RFLP方法能夠準(zhǔn)確鑒定HBV基因型，該方法靈敏性高，特異性強(qiáng)，適宜于HBV基因型的流行病學(xué)調(diào)查。

4 PCR－反向點(diǎn)雜交（PCR－RDB）

該方法將多種核酸檢測探針固定在膜條上，通過與擴(kuò)增后的待檢靶序列雜交，一次即可進(jìn)行多種基因亞型的分類，因此有很高的檢測效率，而且簡單經(jīng)濟(jì)。孔令和等[18]采用PCR－反向點(diǎn)雜交法，對(duì)203例HBV－DNA陽性患者HBV進(jìn)行基因型分析。結(jié)果成功分型199例，其中B型160例，C型24例，B/C混合型14例，D型1例，結(jié)論認(rèn)為該技術(shù)可以簡便地對(duì)HBV進(jìn)行基因型分析，分型成功率高，適用于臨床檢測。楊光等[19]也利用該技術(shù)對(duì)300份HBV－DNA陽性患者血清進(jìn)行HBV基因分型檢測，并與基因測序結(jié)果比較確定該方法的有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可進(jìn)行基因分型，并且基因分型結(jié)果與測序結(jié)果一致。由此認(rèn)為逆向點(diǎn)雜交技術(shù)在進(jìn)行HBV基因分型中具有，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，適用于臨床檢測與流行病學(xué)研究。黃燕萍等[20]利用該技術(shù)檢測21例慢性乙型肝炎患者，經(jīng)對(duì)陽性患者血清標(biāo)本PCR擴(kuò)增，克隆后測序證實(shí)分別為不同的HBV基因型及YMDD變異型。結(jié)論認(rèn)為該方法檢測HBV基因型及YMDD變異，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、準(zhǔn)確快捷，且易于開展。但同時(shí)指出本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量少，需進(jìn)一步的研究及檢測更多的臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。

5 PCR微板核酸雜交－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

該方法首先用PCR擴(kuò)增HBV－DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物加入包被HBV通用探針的微孔板后，再加入HBV各基因型顯色探針，同時(shí)進(jìn)行微板核酸夾心雜交－ELISA顯色，從而確定基因型。此方法將基因擴(kuò)增、核酸分子雜交和酶聯(lián)免疫顯色3種診斷技術(shù)融為一體，發(fā)揮了核酸分子雜交技術(shù)特異性高，PCR檢測技術(shù)靈敏度高和酶聯(lián)顯色檢測方便的優(yōu)點(diǎn)，分型準(zhǔn)確可靠。江秀梅[21]應(yīng)用此方法對(duì)206例HBV－DNA陽性病例進(jìn)行基因分型，結(jié)果B型104例，C型80例，混合型13例，D型9例，分型均獲得成功。王虹等[22]運(yùn)用該方法對(duì)152例乙型肝炎患者的HBV－DNA進(jìn)行基因分型，結(jié)果B型43例、C型57例、D型28例；A型、E型、F型各有5例，同時(shí)還檢測到B、C、D三型不同組合的混合型16例。因此認(rèn)為PCR微板核酸雜交－ELISA方法在進(jìn)行HBV基因分型中具有準(zhǔn)確、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，在觀察各基因型致病性及HBV的流行病學(xué)研究方面有重要意義。

6 其他相關(guān)PCR技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)越來越多的應(yīng)用于HBV基因型的檢測中。例如Chen[23]等設(shè)計(jì)了能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增A～F基因型的多重PCR方法。該法操作簡便，結(jié)果易于判定，可檢測出HBV的混合型感染，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，但其靈敏度和特異度還有待進(jìn)一步提高。黃惠臣[24]根據(jù)A型、B型、C型設(shè)計(jì)引物，對(duì)110例HBV－DNA陽性乙肝病毒感染者進(jìn)行基因分型，結(jié)果僅有7例未能分型，顯示此PCR方法能將本地區(qū)絕大多數(shù)HBV進(jìn)行定型。因此認(rèn)為該方法較基因測序，基因芯片和RFLP分型方法操作簡單、快速、可行。

7 結(jié)語與展望

HBV基因型與乙型肝炎患者的臨床表現(xiàn)、治療效果、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)系，受到國內(nèi)外學(xué)者越來越強(qiáng)烈的關(guān)注，其基因分型方法也隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展而越來越多，但各種分型方法均或多或少地存在某些缺陷與不足，難以廣泛應(yīng)用于臨床和流行病學(xué)調(diào)查。比如：基因序列測定法雖是公認(rèn)的HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但不管是全序列還是S基因序列測定，均繁瑣費(fèi)時(shí)，費(fèi)用較高，不適合臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查；基因型特異性表位單克隆抗體ELISA操作雖然簡便，可對(duì)HBV的A～F基因型進(jìn)行檢測，但其準(zhǔn)確性較PCR差，而且所檢測的標(biāo)本必須是HBV表面抗原陽性血清，對(duì)于混合型感染和HBV表面抗原低水平表達(dá)的標(biāo)本可能無法鑒別；DNA芯片分析具有很高的靈敏性和特異性，可對(duì)核酸序列進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究，但由于設(shè)備要求高，價(jià)格昂貴較少應(yīng)用于臨床。PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉，操作簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，是公認(rèn)的敏感和特異的檢測方法，目前已廣泛應(yīng)用于基因克隆、檢測、配型、遺傳病的診斷、惡性腫瘤和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。其衍生技術(shù)的發(fā)展，使PCR技術(shù)進(jìn)一步完善，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，也廣泛的用于HBV基因分型。但如同其他技術(shù)一樣，該技術(shù)在HBV基因型分型中也存在著一些缺陷，比如型特異引物－PCR分型法雖然是一種比較成熟的基因分型方法，可應(yīng)用于臨床感染診斷和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，但由于受個(gè)別核苷酸變異或病毒載量較低的影響，仍有5%～8%的HBV不能用該方法順利分型；PCR－SSO基因分型法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測所有基因型（A～H），可鑒別某些用直接測序不能區(qū)分的混合型感染，但也只能對(duì)已建立的基因型進(jìn)行分型；PCR－RFLP分型方法因?yàn)椴僮骱啽?，適用于流行病學(xué)調(diào)查研究，但它也存在遇到混合感染或酶切不完全時(shí)，會(huì)出現(xiàn)帶型不清而導(dǎo)致結(jié)果判斷困難的缺點(diǎn)；PCR微板核酸雜交酶聯(lián)免疫分型法雖然綜合運(yùn)用了3種原理，特異性高，易于自動(dòng)化，但雜交后需復(fù)雜的顯色步驟，而且雜交背景也易受各種因素的干擾。盡管以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)在HBV基因型分型中的應(yīng)用還面臨許多困難，但我們相信，隨著分子生物學(xué)的操作技術(shù)不斷發(fā)展與提高，PCR及衍生技術(shù)在HBV基因型分型中一定會(huì)操作更加簡便，敏感和特異性更高，而且更適用于臨床及流行病學(xué)的調(diào)查研究。

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