張敏敏，陳玉梁，趙 瑛，張運(yùn)暉，羅俊杰

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

植物是藥物的重要來(lái)源之一，人類(lèi)利用藥用植物的歷史淵遠(yuǎn)流長(zhǎng)。我國(guó)藥用植物的種質(zhì)資源非常豐富，達(dá)10 000種以上，且大多為野生資源。由于傳統(tǒng)中草藥的獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價(jià)，當(dāng)采集和消耗量超過(guò)自然資源的再生能力時(shí)，必然會(huì)導(dǎo)致物種瀕危甚至滅絕，因此，利用植物組織和細(xì)胞的大量培養(yǎng)合成中藥有效成分成為實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的一條重要途徑［1］。適宜的離體培養(yǎng)條件下，植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物能像植物體一樣進(jìn)行次生代謝，并積累次生代謝產(chǎn)物［2］。藥用植物的有效成分也屬于植物細(xì)胞所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、黃酮、萜類(lèi)、皂甙等。由于這些化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，因此植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)方法則展現(xiàn)出無(wú)可比擬的優(yōu)越性。而藥用植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)價(jià)值如何，主要取決于其合成的有效成分與自然植株間的差異，而誘導(dǎo)成分的產(chǎn)生受到培養(yǎng)條件的多重影響。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在基本培養(yǎng)條件和附加物的添加對(duì)藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)合成次生代謝產(chǎn)物的影響方面進(jìn)行了許多研究，我們對(duì)該領(lǐng)域的相關(guān)研究進(jìn)行了歸納和總結(jié)。

1 研究進(jìn)展

1.1 外植體對(duì)合成次生代謝產(chǎn)物的影響

植物細(xì)胞雖均有全能性，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不同外植體的愈傷誘導(dǎo)率和愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)各不相同，且不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織其次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)及產(chǎn)量也不盡相同。甘草以下胚軸為外植體時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最高，且不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物含量不同，表現(xiàn)為下胚軸愈傷組織中總黃酮含量最高，子葉愈傷組織中甘草酸含量最高［3］；在對(duì)朱砂根愈傷組織的誘導(dǎo)中，各外植體的誘導(dǎo)率雖較為一致，但以胚根為外植體的愈傷組織中巖白菜素含量高于其它愈傷組織［4］。因此，外植體的選擇是利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物有效成分的前提。

1.2 培養(yǎng)基對(duì)合成次生代謝產(chǎn)物的影響

1.2.1 基本培養(yǎng)基 不同種類(lèi)的基本培養(yǎng)基對(duì)植物組織培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物的形成有很大的影響。如紫草在White培養(yǎng)基上能夠合成紫草寧衍生物，而在LS等培養(yǎng)基上則不能合成［5］；又如B5培養(yǎng)基有利于杜仲愈傷組織中總黃酮的形成，而1/2MS培養(yǎng)基則有利于綠原酸的積累［6］；嚴(yán)海燕等對(duì)硬紫草的研究表明，改良的B5培養(yǎng)基有利于愈傷組織的生長(zhǎng)，而M9培養(yǎng)基有利于紫草素的形成，于是選擇了以B5培養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而M9培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基的兩階段培養(yǎng)技術(shù)［7］。這種兩步培養(yǎng)法較好的解決了細(xì)胞生物量增長(zhǎng)與次生代謝產(chǎn)物積累之間的矛盾，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率，現(xiàn)已較廣泛地應(yīng)用于黃連、黃花蒿等藥用植物的培養(yǎng)中。

1.2.2 碳源 碳源不僅能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，同時(shí)也是碳骨架的組成成分。在1987年，Smith等對(duì)長(zhǎng)春花的研究即發(fā)現(xiàn)，以乳糖替代蔗糖可明顯提高組織培養(yǎng)物的生物量和長(zhǎng)春質(zhì)堿的產(chǎn)量［8］；李琰等對(duì)雷公藤的研究表明，蔗糖有利于雷公藤愈傷組織的生長(zhǎng)，麥芽糖有利于其內(nèi)脂醇的合成，葡萄糖則有利于其總生物堿的積累［9］。可見(jiàn)選擇適宜的碳源對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有促進(jìn)作用。

1.2.3 氮源 不同植物對(duì)NO3-和NH4+的利用率不同，且單獨(dú)以硝酸鹽或銨鹽為氮源，都不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝物的生成。因此，設(shè)置適宜的氮源及比例有助于細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生成。如在水母雪蓮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，氮源總量為60～120mmol/L，且NO3-/NH4+比例為4∶2時(shí)有利于細(xì)胞增長(zhǎng)及黃酮的合成［10］；而玫瑰茄懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，氮源總量為13.5 mmol/L時(shí)即足夠維持玫瑰茄細(xì)胞的生長(zhǎng)和花青素的合成，且當(dāng)NO3-/NH4+比例為25∶2和25∶4時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和花青素合成最佳［11］；甘草愈傷組織培養(yǎng)中，總氮濃度為60mmol/L，NO3-/NH4+為2∶1時(shí)，甘草愈傷組織中5種黃酮類(lèi)化合物含量的總和達(dá)到最大值［12］。

1.2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素主要包括2，4-D、IAA、IBA、NAA等，細(xì)胞分裂素包括BA、2ip、KT等。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)和分化狀態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)也具有重要的影響。如在三分三愈傷組織培養(yǎng)中，低濃度2，4-D能刺激生物堿的合成，但延緩生長(zhǎng)；高濃度2，4-D雖能刺激愈傷組織生長(zhǎng)但抑制生物堿的合成。而NAA既能促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)又能促進(jìn)生物堿的合成［13～14］。雷公藤愈傷組織培養(yǎng)中，2，4-D有利于雷公藤愈傷組織生長(zhǎng)和總生物堿的積累，6-BA抑制愈傷組織生長(zhǎng)但明顯促進(jìn)內(nèi)酯醇的形成［8］?？梢?jiàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是藥用植物有效成分目的化生產(chǎn)的重要因素之一。

1.2.5 光照 光照對(duì)藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的影響主要體現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)及光照時(shí)間三個(gè)方面。如在不同光照強(qiáng)度下對(duì)虎杖愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織中白藜蘆醇的含量從大到小依次為弱光、強(qiáng)光、暗光，且弱光下白藜蘆醇的含量是同期所采野生品種的2倍［15］；又如以不同光質(zhì)對(duì)朱砂根愈傷組織進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)綠光最利于巖白菜素的生成，藍(lán)光和白光次之，紅光最差［16］；在杜仲愈傷組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，12 h/d光照對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)及綠原酸和總黃酮的合成有明顯的促進(jìn)作用，黑暗雖不影響愈傷組織的生長(zhǎng)，但卻抑制綠原酸和總黃酮的形成［17］。

1.2.6 pH 盛長(zhǎng)忠等的研究表明，南方紅豆杉的愈傷組織生長(zhǎng)及紫杉醇含量受pH的影響較大，pH為5.5時(shí)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)最為有利，達(dá)接種量的3.84倍；但紫杉醇的含量較低且pH為7.0時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)量雖然相對(duì)較低，但紫杉醇含量卻是pH為5.5時(shí)的2倍多［18］。因此，選擇適宜的pH值對(duì)于植物組織的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成也有一定的促進(jìn)作用。

1.3 附加物對(duì)藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)及有效成分生產(chǎn)的影響

植物次生代謝產(chǎn)物是一大類(lèi)小分子化合物，基礎(chǔ)含量一般都很低。而在生物受到脅迫或出于一定的誘導(dǎo)條件下，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量通常都有一定的提高［19］，因此，鹽脅迫、旱脅迫等脅迫因子以及誘導(dǎo)子的特殊誘導(dǎo)作用受到廣泛關(guān)注。同時(shí)，隨著次生代謝產(chǎn)物合成途徑的進(jìn)一步闡明，前體物質(zhì)和相關(guān)代謝酶的添加也成為提高目的產(chǎn)物的有效手段。

1.3.1 誘導(dǎo)子的應(yīng)用 從植物病理學(xué)的角度講，誘導(dǎo)子是指在抗病生理過(guò)程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植保素和引起植物過(guò)敏反應(yīng)的因子，從細(xì)胞培養(yǎng)的角度講是指能促進(jìn)植物細(xì)胞產(chǎn)生目的產(chǎn)物因子［20］。根據(jù)這個(gè)原理，近年來(lái)該項(xiàng)研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，并取得了較大的進(jìn)展。如Lu等發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子的加入能使人參懸浮細(xì)胞中的皂甙含量達(dá)到細(xì)胞干重的2.07%，是未加誘導(dǎo)子的28倍［21］。Wang等發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉的細(xì)胞培養(yǎng)中加入100 uM的茉莉酸甲酯作為誘導(dǎo)子，紫杉醇的含量能提高到對(duì)照的25.7倍［22］。文濤等以黑曲霉、啤酒酵母、青霉、灰葡萄孢的提取物為真菌誘導(dǎo)子對(duì)虎杖愈傷組織進(jìn)行處理，結(jié)果為黑曲霉、青霉、灰葡萄孢3種真菌誘導(dǎo)子均對(duì)白藜蘆醇的合成有促進(jìn)作用，其中黑曲霉作用最顯著，比對(duì)照提高了50.2%，而啤酒酵母提取物對(duì)白藜蘆醇的合成具有抑制作用［23］。楊世海等以稀土元素作為新型誘導(dǎo)子，也取得了喜人的結(jié)果，即低濃度的稀土元素Eu3+對(duì)甘草愈傷組織中黃酮類(lèi)化合物的合成具有明顯的促進(jìn)作用，且當(dāng)其濃度為0.1 mg/L時(shí)最有利于黃酮類(lèi)化合物的積累，總黃酮含量可為對(duì)照的2.7倍，其中甘草素的含量是對(duì)照的4倍［24］?？梢?jiàn)選擇適宜的誘導(dǎo)子對(duì)藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)及有效成分的積累具有積極的促進(jìn)作用。

1.3.2 前體物質(zhì)及代謝酶的影響 前體物質(zhì)指某一代謝中間體前一階段的物質(zhì)，添加前體物質(zhì)會(huì)影響植物組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成。Zhao等在培養(yǎng)長(zhǎng)春花細(xì)胞的系統(tǒng)中加入琥珀酸色氨和色氨酸等前體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞產(chǎn)生的長(zhǎng)春花堿和西蘿芙木堿是未經(jīng)處理的4倍多［25］。Fett-Neto的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中加入前體物質(zhì)苯丙氨酸能使紫杉醇含量提高5倍［26］。而代謝酶的研究目前主要是應(yīng)用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的方法分離和克隆出代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，并經(jīng)過(guò)修飾和載體構(gòu)建后轉(zhuǎn)化到目的植物的基因組中，從而構(gòu)建目的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)細(xì)胞系。如Canel和Geerlings對(duì)長(zhǎng)春花的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶與長(zhǎng)春花細(xì)胞合成吲哚類(lèi)和喹啉類(lèi)生物堿相關(guān)，采用分子遺傳學(xué)方式超量表達(dá)這兩種酶后，生物堿產(chǎn)量達(dá)到200 mg/L的高水平，說(shuō)明這兩種酶對(duì)長(zhǎng)春花生物堿的合成具有明顯促進(jìn)作用［27～28］。Yamamura等和Yamamoto等分別研究了桂皮酸羥化酶和牦牛酸氫醌羥化酶對(duì)紫草細(xì)胞中紫草素合成的影響，結(jié)果這兩種酶在紫草細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量與紫草素的合成速度明顯相關(guān)，并已將其基因克隆，同時(shí)說(shuō)明了通過(guò)外源基因調(diào)節(jié)紫草素的合成是可能的［29～30］。可見(jiàn)目的產(chǎn)物代謝途徑的研究對(duì)提高其產(chǎn)量具有重要的意義。

2 展望

1952年Routien和Nickel首次提出用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能生產(chǎn)有用次級(jí)代謝產(chǎn)物的觀點(diǎn)開(kāi)始［31］，利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)方法合成天然產(chǎn)物的研究便迅速地發(fā)展起來(lái)。如今已能利用紫草細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧，紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉醇等已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，其他藥用植物利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)有效成分也取得了很大的成就，但達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的應(yīng)用并不多，很多藥用植物組織和細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物含量不及原植物，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高。因此控制和調(diào)節(jié)藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)及有效成分合成中的相關(guān)可控條件，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)誘導(dǎo)子作用機(jī)制和目的產(chǎn)物代謝途徑的研究，對(duì)提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)也將進(jìn)一步推進(jìn)利用藥用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的工業(yè)化進(jìn)程。

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