耿 燕， 陽紅梅， 許泓瑜， 史勁松

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122）

滇 結(jié) 香 （Edgeworthia gardneri （Wall.） Meissn）主要產(chǎn)于西藏和云南地區(qū)[1-2]，其俗名為西藏綠蘿花，據(jù)《藏醫(yī)養(yǎng)身圖說》，主治糖尿病、冠心病、高血壓、高血脂、血管炎及脈管炎等。 結(jié)香花（Edgeworthia chrysantha） 常作為密蒙花（Buddliga officinalis）的偽品進(jìn)行銷售[3-4]。而綠蘿花為天南星科（Araceae）植物，與結(jié)香在外形上差異很多，二者混淆的原因可能在于“夢(mèng)（夢(mèng)）花”與“蘿花”的誤讀和誤解[5]。目前，據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從結(jié)香中分離出的化合物主要有香豆素類、黃酮類、甾類、有機(jī)酸及含氮化合物等，具有抗菌、消炎和鎮(zhèn)痛的作用[1-2]。西藏當(dāng)?shù)鼐用駥⒌峤Y(jié)香花通過泡水飲用的方式來治療糖尿病等慢性疾病，但未探明作用機(jī)理。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)香中的瑞香黃烷素能抑制腸道上皮的α葡萄糖苷酶活性[6]，抑制小腸α葡萄糖苷酶活性是藥物降血糖機(jī)理之一[7-9]，故擬通過研究西藏產(chǎn)滇結(jié)香花提取物對(duì)α葡萄糖苷酶活性的影響來探尋其活性物質(zhì)。滇結(jié)香花在民間有廣泛的用途，但筆者未見對(duì)其安全性評(píng)價(jià)的資料，作者通過對(duì)其活性較好的組分進(jìn)行體內(nèi)急毒評(píng)價(jià)，并在小鼠高血糖模型基礎(chǔ)上研究其降糖活性，為深入開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

滇結(jié)香（西藏綠蘿花），由西藏月王生物科技有限公司提供；經(jīng)鑒定為滇結(jié)香，為瑞香科、結(jié)香屬植物，標(biāo)本保藏于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物標(biāo)本室。阿卡波糖，購自德國拜爾公司；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯 a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），購自sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒及谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，購自南京建成科技有限公司；其余試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周昆明小鼠，購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證號(hào):SCXK（滬）2003-0003）；健康雄性 SD（Sprague Dawley）大鼠，體重 200～240 g ，3 月齡，購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證號(hào):SCXK（滬）2007-0005）。

1.3 儀器

EL204型電子天平，博特勒托利多公司制造；UV-2100型紫外分光光度計(jì)，上海UNICO儀器有限公司制造；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司制；恒溫水浴循環(huán)鍋，美國POLYSCIENCE制；SpectrAA 220型原子吸收分光光度計(jì)，Varian公司制；UV1800型紫外分光光度計(jì)，上海美諾達(dá)科技有限公司制；Triad冷凍干燥儀，美國 Labeonco公司制；MULTISKAN ASCENT酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司制。

2 方法

2.1 α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)

分別選用Sigma公司的酵母源α-葡萄糖苷酶及自提的大鼠α-葡萄糖苷酶，提取方法參考文獻(xiàn)[10]。對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的具體實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)處理見文獻(xiàn)[11]。

2.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

選取正常昆明小鼠，隨機(jī)分為4個(gè)劑量組（n=10），雌雄各半，共8組，灌胃給藥:正常對(duì)照組；滇結(jié)香水提物（EMW）給藥組（1 000、2 500、5 000 mg/kg）。觀察14 d后，通過摘眼球的方式采取動(dòng)物的血液，靜置 3～4 h，血液分層后，2500 r/min 離心 40 min，取上清液，以備血清生化學(xué)指標(biāo)檢測，然后將各組動(dòng)物處死，摘取小鼠肝臟等器官，沖洗干凈并稱重。血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定按試劑盒說明。動(dòng)物頸椎脫臼處死，觀察心、肝、腎、肺、脾、腦、胃等器官的體積、顏色、質(zhì)地及質(zhì)量等的改變，計(jì)算器官指數(shù)。器官指數(shù)=器官質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

2.3 高血糖模型的建立

90只4周齡雄性昆明小鼠禁食12 h后剪尾取血，用Free-style血糖試紙測定基礎(chǔ)血糖水平，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和模型組（80只）。模型對(duì)照組根據(jù)體重左下腹腔注射ALX 150 mg/kg，正常對(duì)照組注射生理鹽水，觀察3 d。在給藥第4天后血糖上升到（7.5±1.237）mmol/L，再次注射 50 mg/（kg·d），測定空腹血糖水平，第7天測定其血糖，血糖水平≥11.1 mmol/L確定為高血糖模型。建模成功率為70%。將建好的糖尿病動(dòng)物模型隨機(jī)分為EMW高劑量組（300 mg/kg）、EMW 中劑量組（200 mg/kg）、EMW低劑量組 （100 mg/kg）、阿卡波糖對(duì)照組（20 mg/kg）、生理鹽水對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠皮毛、進(jìn)食、飲水、尿量、體重等生理情況。給藥后0、0.5、1、2、3、4、5、6 h 采集血樣， 血糖儀測定血糖值。計(jì)算給藥后不同時(shí)間的血糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即

各組分給藥后0 h血糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）標(biāo)示，顯著水平為p＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 滇結(jié)香花活性物質(zhì)的粗提

稱取150 g滇結(jié)香花，按溶劑的極性大小不同，選擇正己烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水1 500 mL依次提取2 h，每種溶劑提3次，合并提取液，抽濾掉滇結(jié)香花渣滓，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適宜體積。濃縮后有機(jī)溶劑粗提物用離心濃縮儀離心濃縮至粉末，水粗提物用凍干機(jī)凍干至粉末，備用。滇結(jié)香花的正己烷提取率為7.34%、石油醚提取率為14.13%、乙酸乙酯提取率為8.74%、甲醇提取率為11.08%、水提取率為12.24%。

3.2 滇結(jié)香花各溶劑粗提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的初步研究

分別測定滇結(jié)香花的 5種提取物和陽性對(duì)照阿卡波糖在相同系列質(zhì)量濃度下（1 000 mg/kg、1 500 mg/kg、2 000 mg/kg）其對(duì)酵母源與大鼠源α葡萄糖苷酶的抑制活性。表1顯示各粗提物在不同篩選濃度下，抑制效果變化不大，除正己烷提取物外，質(zhì)量濃度1 000 mg/kg時(shí)，其它 5種提取物對(duì)酵母來源α葡萄糖苷酶的抑制活性均高于陽性對(duì)照藥阿卡波糖（（30.67±1.32）%），且存在顯著差異（p＜0.05或p＜0.01）。 而對(duì)大鼠源α葡萄糖苷酶，僅有水提物的抑制活性（（34.20±1.36）%）高于阿卡波糖（（28.80±1.78）%），且存在顯著差異（p＜0.05）。 表明僅有EMW質(zhì)量濃度1 000 mg/kg時(shí)具有較好的酵母源和大鼠源α葡萄糖苷酶抑制活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，酵母來源α葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)存在一定的假陽性情況[8-9]，應(yīng)優(yōu)先考慮采用動(dòng)物來源的α葡萄糖苷酶，綜合考慮，滇結(jié)香花水提取物體外抑制活性最好。

表1 滇結(jié)香花提取物對(duì)酵母和大鼠來源α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性Table 1 Yeast and rat intestinal α-glucosidase inhibitory activity of different extracts from E.gardneri in vitro

3.3 滇結(jié)香花水粗提取物急性毒性作用初步研究

選擇有較明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性的水提物進(jìn)行急性毒性初探。經(jīng)預(yù)試，無法做出LD50，滇結(jié)香花水提取物致死量大于5 000 mg/kg，毒性較低。不同滇結(jié)香水提物給藥組（1000、2500、5 000 mg/kg）一次給藥觀察14 d期間小鼠的死亡率為0。小鼠飲食、飲水、體重、皮毛與正常組比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性與正常組比較（圖1），沒有顯著差別。心、肝、腎、肺、脾、腦、胃等器官指數(shù)顯示（表2-3），滇結(jié)香花水提物無明顯的器官毒副作用。

圖1 滇結(jié)香花水提物一次灌胃14 d后對(duì)小鼠GOT和GPT的影響Fig.1 Effect of oral administration of EMW once on the activity of GOT and GPT in mice after 14 days

表2 雄性小鼠一次灌胃滇結(jié)香花水提物14 d后其器官指數(shù)（mean±SD，n=10）Tab.2 Organ index of oral administration of EMW once in male mice after 14 days （mean±SD，n=10）

3.4 滇結(jié)香花水提物對(duì)高血糖模型組小鼠的影響

滇結(jié)香花水提物在體外有較高的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用且無明顯毒副作用，進(jìn)一步在動(dòng)物整體水平考察其降血糖的活性。如圖2所示，阿卡波糖給藥0.5 h后即可下調(diào)高血糖模型小鼠血糖水平，給藥1～3 h血糖下降幅度最大，與對(duì)照組相比存在顯著差異 （p＜0.05），給藥4 h后血糖回升至0 h濃度。EMW高中低劑量給藥在1 h后都可下調(diào)小鼠血糖水平，但低劑量（100 mg/kg）給藥3 h后血糖回升至原來濃度。EMW中劑量給藥（200 mg/kg）3 h后小鼠血糖下降幅度最大，2～4 h小鼠血糖質(zhì)量比數(shù)對(duì)照組相比存在顯著差異（p＜0.05），5 h后血糖回升至0 h濃度。EMW高劑量給藥（300 mg/kg）4 h后血糖下降幅度最大，2～5 h與對(duì)照組相比存在顯著差異（p＜0.05），給藥6 h后血糖回升至0 h濃度。滇結(jié)香花水提物對(duì)高血糖模型小鼠的降血糖幅度大小、藥效持續(xù)時(shí)間與給藥濃度成正比，與陽性藥物相比對(duì)血糖控制作用更持久并且效果溫和。

表3 雌性小鼠一次灌胃滇結(jié)香花水提物14 d后其器官指數(shù)（mean±SD，n=10）Tab.3 Organ index of oral administration of EMW once in female mice after 14 days（mean±SD，n=10）

圖2 滇結(jié)香花水提物對(duì)高血糖模型小鼠血糖的影響Fig.2 Effect of EMW on the blood concentration in hyperglycemia mice

4 結(jié)語

目前醫(yī)學(xué)界已將α-葡萄糖苷酶抑制劑列為第3類口服降糖藥[12]。此類藥物對(duì)一、二型糖尿病均適用。代表藥物如阿卡波糖，其作用機(jī)制為抑制位于小腸絨毛上皮細(xì)胞刷狀緣的α-糖苷酶的活性從而抑制二糖和低聚糖降解為單糖如葡萄糖，進(jìn)而延緩葡萄糖的吸收，并轉(zhuǎn)化葡萄糖依賴的腸激素的釋放，但其有腹部不適、腹瀉、胃腸脹氣等不良反應(yīng)。中藥等天然藥物降血糖療效明確，副作用小[13]，作者采用α葡萄糖苷酶體外抑制模型對(duì)產(chǎn)于西藏地區(qū)的滇結(jié)香花進(jìn)行降糖活性組分篩選，結(jié)果表明，滇結(jié)香花水提取物體外抑制活性最好。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明滇結(jié)香花水提取物無明顯毒副作用，且水提物對(duì)小鼠高血糖模型有一定的降糖作用，故可對(duì)該提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，追蹤其活性成分，并在動(dòng)物整體水平評(píng)價(jià)其降糖作用，進(jìn)而研究其調(diào)節(jié)血糖的機(jī)制，這些研究將有助于開發(fā)治療糖尿病的新藥。

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