朱紅菊 ， 丁 玉 ， 賈亞偉

（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 國(guó)家煤加工與潔凈化工程技術(shù)研究中心，江蘇 徐州221116；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116；3.江蘇洋河酒廠股份有限公司技術(shù)中心，江蘇 宿遷 223800）

橙皮苷具有抗氧化、降血脂、消炎、維持滲透壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性及降低膽固醇等作用[1-3]，被廣泛用于醫(yī)藥及日用化工等領(lǐng)域[4-6]。同時(shí)，作為天然抗氧化劑、食品添加劑、果蔬保鮮劑及保健品等，也被食品行業(yè)廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)的雙水相體系是由兩種水溶性高分子或一種水溶性高分子與無(wú)機(jī)鹽組成的混合體系。與其他常規(guī)分離方法相比，其顯著特點(diǎn)及獨(dú)有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于：由于兩相均為水相，故兩相界面張力極低，大大低于有機(jī)溶劑與水相之間的相間張力，故相分離條件溫和，相間傳質(zhì)和平衡過(guò)程迅速，產(chǎn)物回收率高。另外，低的界面張力有助于保持被分離物質(zhì)的生物活性，特別適合于分離有生物活性的物質(zhì)，在生物大分子等生物類(lèi)產(chǎn)品的分離過(guò)程中得到廣泛應(yīng)用[7]?；诖?，為了增加雙水相體系的選擇性，近年來(lái)有諸如雙水相與其它分離技術(shù)的集成化、親和雙水相等萃取技術(shù)的不斷發(fā)展[8-10]。但這類(lèi)雙水相體系的主要不足是用于分離的高分子聚合物價(jià)格昂貴、難以回收、黏度大、聚合物難處理及環(huán)境污染等[11]，限制了它們的工業(yè)化應(yīng)用。

近年來(lái)，先后出現(xiàn)了無(wú)機(jī)鹽-低分子有機(jī)溶劑雙水相體系[12]、離子液體雙水相體系[13-15]，以及表面活性劑的雙水相體系[16]等。這類(lèi)雙水相體系具有傳統(tǒng)體系所沒(méi)有的一些特點(diǎn)，如分相快、成本低、易于處理等。其中以無(wú)機(jī)鹽/低分子有機(jī)溶劑形成的雙水相體系最為價(jià)廉、易得，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用[17-20]，且多以微波、超聲等手段輔助，以增強(qiáng)萃取效果。用于黃酮類(lèi)化合物提取的這類(lèi)雙水相體系主要是由一些低分子醇類(lèi)與硫酸銨構(gòu)成[17-18，20]，多用于不同天然產(chǎn)物中黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離。但這類(lèi)體系對(duì)橙皮苷的選擇性如何，則研究較少，而對(duì)于除低分子醇類(lèi)之外的有機(jī)溶劑更少有人涉及。由于分離是利用目的產(chǎn)物與雜質(zhì)的性質(zhì)不同而進(jìn)行，故萃取介質(zhì)的不同必然會(huì)影響目的產(chǎn)物的分離程度。因此，有必要對(duì)低分子醇類(lèi)以外的有機(jī)溶劑及硫酸銨以外的鹽類(lèi)的雙水相構(gòu)成及性質(zhì)進(jìn)行研究，以尋求最佳的雙水相萃取體系，豐富雙水相的構(gòu)成。

作者采用新型親水性低分子有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系純化橙皮苷，輔以纖維素酶助提取，考察不同的低分子有機(jī)物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽類(lèi)對(duì)橙皮苷純化的影響。采用制備型高效液相色譜（HPLC）對(duì)其進(jìn)一步純化。用HPLC檢測(cè)所得橙皮苷的純度及橙皮苷回收率，以考察新型雙水相體系對(duì)橙皮苷的分離特異性及其純化效率。

1 材料與方法

1.1 粗提物制備

市購(gòu)蜜桔取皮、清洗、冷凍干燥至恒重。粉碎、過(guò)40目篩，所得桔皮粉冷藏備用。

取適量桔皮粉于錐形瓶中，加入乙醇并輔以纖維素酶，水浴振蕩浸提30 min后滅酶、冷卻，抽濾得粗提液待用。

1.2 雙水相成相

關(guān)于乙醇、丙醇等低分子醇類(lèi)與硫酸銨形成的雙水相體系研究者眾多，故本研究取異丙醇、丙酮及3種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)構(gòu)建雙水相體系，進(jìn)一步考察這類(lèi)物質(zhì)的成相性質(zhì)及對(duì)目的產(chǎn)物的選擇性。

分別取異丙醇/（NH4）2SO4、異丙醇/Na2CO3、異丙醇/K2HPO4、丙 酮/（NH4）2SO4、 丙酮/Na2CO3、丙 酮/K2HPO46對(duì)物質(zhì)進(jìn)行研究，用濁點(diǎn)法繪制各自雙節(jié)線圖（相圖），考察最優(yōu)成相、萃取體系。

1.3 雙水相體系萃取

將一定量構(gòu)成雙水相體系的有機(jī)溶劑、無(wú)機(jī)鹽置于離心管中，取橙皮苷粗提液與之混合，調(diào)節(jié)pH，旋渦混合，一定溫度下恒溫萃取一定時(shí)間后，記錄兩相體積，用紫外分光光度法測(cè)定橙皮苷濃度。計(jì)算相比R，分配系數(shù)K和回收率Y。

1.4 橙皮苷粗品制備

將雙水相上相溶液加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液調(diào)pH為4.0，加熱至65℃，冷卻過(guò)夜結(jié)晶，過(guò)濾洗滌數(shù)次，真空冷凍干燥得橙皮苷粗品。

1.5 制備型HPLC精制

將所得粗品用流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)濃度，與標(biāo)準(zhǔn)品溶液及流動(dòng)相進(jìn)行超聲處理，過(guò)0.45 μm的濾膜后上樣。梯度洗脫，收集主要峰值流出液。

制備條件：色譜柱DAC-HB50-C18（Φ50 mm×250 mm，10 μm）；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 286 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量15 mL；流動(dòng)相體積流量55 mL/min。

1.6 相關(guān)計(jì)算

1.6.1 雙水相萃取收率

式（1）中：R為雙水相體系上下相體積之比；K為雙水相體系分配系數(shù)。

1.6.2 相比

式（2）中：Vt，Vb為雙水相體系上、下相體積，mL。

1.6.3 分配系數(shù)

式（3）中：Ct，Cb為上、下相中橙皮苷的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.6.5 總回收率Y計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系萃取橙皮苷

2.1.1 雙水相體系成相研究 一般認(rèn)為，普通有機(jī)物形成雙水相是鹽溶液與有機(jī)溶劑爭(zhēng)奪水分子形成締合水合物的結(jié)果。通過(guò)繪制雙水相雙節(jié)線圖，選擇合適的雙水相體系。3種鹽分別與丙酮、異丙醇構(gòu)成雙水相體系，見(jiàn)圖1。

圖1 不同雙水相體系的成相相圖Fig.1 Phase diagram for different aqueous two-phase Systems

由圖1可以看出，碳酸鈉形成穩(wěn)定的雙水相體系所需鹽及醇量均較少，意即其分相能力最強(qiáng)。磷酸氫二鉀具有較寬的分相范圍。

2.1.2 雙水相體系構(gòu)成對(duì)橙皮苷選擇性的影響取碳酸鈉與磷酸氫二鉀進(jìn)一步研究，分別與異丙醇、丙酮構(gòu)成4組雙水相體系，即異丙醇/Na2CO3、異丙醇/K2HPO4、丙酮/Na2CO3、丙酮/K2HPO4體系，探討橙皮苷粗品在兩相間的分配情況，考察體系對(duì)橙皮苷的選擇性。各體系的成相相比、分配系數(shù)及橙皮苷收率見(jiàn)表1。

表1 橙皮苷在不同雙水相體系中分配效果比較Table 1 Comparison ofhesperidin partitioning in different aqueous two-phase systems

由表1可知，橙皮苷在丙酮/K2HPO4體系中雖然相比不太理想，但分配系數(shù)較大，表明該體系的選擇性較高，其回收率Y1可達(dá)到93.77%。因而確定丙酮/K2HPO4體系作為萃取橙皮苷的適宜雙水相體系。

2.1.3 丙酮和K2HPO4質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷選擇性的影響 取系統(tǒng)總質(zhì)量20 g，加入相當(dāng)0.20 g橙皮苷的粗提液，在pH 9.0、室溫情況下，考察K2HPO4、丙酮質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷粗品在兩相間的選擇性及回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，K2HPO4、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)橙皮苷粗品的萃取效果影響較為顯著；當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著丙酮量的增加，分配系數(shù)K和萃取率Y1總是先明顯上升，而后趨于平穩(wěn)或略有下降。這是由于體系分相能力隨丙酮量增加而增大，更有利于橙皮苷分配于上相，提高萃取率；但丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，就會(huì)有更多的水進(jìn)入上相，而使分配系數(shù)降低，同時(shí)K2HPO4的水化作用不足以?shī)Z取這些水分子而出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。而K2HPO4的量也不宜太高，否則導(dǎo)致相比進(jìn)一步降低，加之鹽析的同時(shí)作用，會(huì)造成橙皮苷萃取率下降，導(dǎo)致原料浪費(fèi)。欲提高萃取收率Y1，必須同時(shí)考慮分配系數(shù)K和相比R兩個(gè)參數(shù)的作用。因此，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%丙酮-質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%K2HPO4構(gòu)成的雙水相體系作為后續(xù)萃取體系。

圖2 K2HPO4、丙酮質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷粗品選擇性影響Fig.2 Effect of dipotassium hydrogen phosphate and acetone concentration on the selectivety of crude hesperidin

2.1.4 粗提物用量對(duì)橙皮苷選擇性的影響 仍取系統(tǒng)總質(zhì)量為20 g、pH 9.0，室溫操作，固定K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%，考察粗提物加入量對(duì)橙皮苷萃取過(guò)程的影響，結(jié)果示于表2。

繼續(xù)加大人才培養(yǎng)與引進(jìn)力度，一方面支持在崗職工通過(guò)外出進(jìn)修學(xué)習(xí)、出國(guó)深造、提升學(xué)歷等途徑，不斷提升現(xiàn)有醫(yī)務(wù)人員的工作能力和學(xué)歷層次。另一方面，則通過(guò)廣納各方賢才，吸引更多優(yōu)秀的高層次人才來(lái)院工作，進(jìn)一步優(yōu)化學(xué)科結(jié)構(gòu)，形成合理的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)醫(yī)院的可持續(xù)發(fā)展。

由表2可以看出，分配系數(shù)K、萃取率Y1隨著粗提物量的加大而不斷波動(dòng)，但在用量達(dá)到0.4 g后，相比下降，Y呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜合考慮，取粗提物用量為0.4 g。

2.1.5 溫度對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響 固定上述條件，即系統(tǒng)總質(zhì)量20 g，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%，pH 9.0，粗提物加入量0.4 g。不同溫度下橙皮苷粗品的萃取收率與分配系數(shù)等參數(shù)變化如表3所示。

表2 粗提物用量對(duì)橙皮苷分配的影響Table 2 Effect of the amount of crude hesperidin on its partitioning

表3 溫度對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響Table 3 Effect of temperature on the partition coefficient of crude hesperidin

由表3可知，隨著溫度上升，分配系數(shù)略有增加，相比未見(jiàn)變化，橙皮苷的萃取收率幾乎無(wú)變化。出于操作方便和節(jié)能降耗的考慮，萃取溫度取為室溫。

2.1.6 pH值的影響 萃取條件固定為：系統(tǒng)總質(zhì)量為20 g，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，室溫，粗提物加入量0.4 g。一般而言，丙酮/K2HPO4雙水相體系成相時(shí)，溶液pH范圍在7～12之間。因此，考察此區(qū)間內(nèi)pH值對(duì)橙皮苷粗品萃取過(guò)程的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 pH值對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響Table 4 Effect of pH value on the partition coefficient of crude hesperidin

由表4可知，pH值在7～10之間時(shí)，隨著pH值的增加，相比R與分配系數(shù)K不斷增大，橙皮苷萃取收率上升趨勢(shì)顯著，pH=10時(shí)萃取收率達(dá)到最大值。pH大于10后，相比與選擇性均降低，萃取收率亦緩慢下降。這可能是因?yàn)樵趐H＜10時(shí)，隨著pH的增加，溶液中水解產(chǎn)生的H2PO4-減少而HPO42-相應(yīng)有所增加。負(fù)電荷的增多致使其對(duì)橙皮苷酚羥基氧負(fù)離子的排斥作用增強(qiáng)，從而促使更多的橙皮苷分配于上相，提高了橙皮苷的分配系數(shù)。pH＞10后，K2HPO4會(huì)進(jìn)一步電離，上、下相的差別縮小，從而使得橙皮苷的選擇性減少。最后導(dǎo)致其萃取收率下降。

2.2 HPLC制備橙皮苷

2.2.1 流動(dòng)相及洗脫方式對(duì)橙皮苷分離的影響以甲醇溶劑為對(duì)照液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)量濃度1.5 mg/mL的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品于波長(zhǎng)200～600 nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)連續(xù)掃描，發(fā)現(xiàn)在286 nm處有特征吸收峰。因此，以286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)雙水相純化后的橙皮苷樣品進(jìn)行HPLC精制純化。

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品溶液，按一定的色譜條件進(jìn)行HPLC實(shí)驗(yàn)?？疾觳煌鲃?dòng)相及洗脫方式對(duì)樣品分離效果的影響。按以下3種洗脫方式進(jìn)行考察：

1）純甲醇洗脫方式。

2）固定 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 的洗脫方式。

3）梯度洗脫方式。以甲醇與水的初始體積比例為40∶60開(kāi)始，不斷增加甲醇比例至二者體積比例達(dá)到1∶1。而后，逐漸恢復(fù)初始比例，直至洗脫結(jié)束。所得結(jié)果分別示于圖3—5。

圖3 純甲醇洗脫時(shí)樣品的流出情況Fig.3 Elution profile while methanol as the elution solvent

圖4 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 比例洗脫時(shí)樣品流出情況Fig.4 Elution profile of sample when the ratio of methanol to water is 45∶55

圖5 梯度洗脫時(shí)樣品流出情況Fig.5 Elution profile of sample as gradient elution strategy

由圖3—5可見(jiàn)，流動(dòng)相為純甲醇時(shí)，出峰時(shí)間較早，但是分離效果較差，并且有拖尾現(xiàn)象和溶劑峰干擾；流動(dòng)相為甲醇-水（體積比 45∶55）時(shí)，出峰時(shí)間較適宜，峰形較佳，但部分組分不能完全分開(kāi)；流動(dòng)相為梯度洗脫時(shí)，出峰時(shí)間適中，每個(gè)組分基本可逐一分離，但個(gè)別峰有前滯現(xiàn)象。綜合考慮，采取梯度洗脫法精制橙皮苷。

2.2.2 HPLC精制橙皮苷 按以上色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行精制。以質(zhì)量濃度1.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品作為基準(zhǔn)，對(duì)相當(dāng)質(zhì)量濃度3.0 mg/mL的樣品進(jìn)行梯度分離。收集峰流出液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收甲醇溶劑。所得產(chǎn)品用去離子水洗滌數(shù)次，真空干燥得橙皮苷精制品。

2.3 產(chǎn)品純度分析 分別將橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、雙水相純化樣品及HPLC精制樣品配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL的溶液，用HPLC分析色譜對(duì)各樣品進(jìn)行分析，通過(guò)面積歸一化方法計(jì)算各出峰組分的百分比，近似看作各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。3種樣品的色譜如圖6—8所示。

根據(jù)圖6橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的分析色譜圖，可知圖7中出峰時(shí)間7.380 min即第4個(gè)峰為橙皮苷，面積歸一化得面積分?jǐn)?shù)71.36%，即雙水相純化后的橙皮苷干樣品純度約為71.36%。

圖6 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品分析圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of the standard hesperidin

圖7 雙水相純化樣品分析圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of purified hesperidin

圖8 HPLC精制品分析圖譜Fig.8 HPLC chromatogram of the refined hesperidin

圖8中保留時(shí)間7.375 min處的峰與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（7.373 min）保留時(shí)間一致，歸一化面積分?jǐn)?shù)為96.09%，即制備型HPLC系統(tǒng)制備得到的橙皮苷干品純度約為96.09%。

制備型HPLC精制橙皮苷回收率

則橙皮苷總回收率

由雙水相純化樣品的分析圖譜可以看出，丙酮/K2HPO4體系對(duì)橙皮苷有一定的富集、純化作用。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品可知，除主要成分橙皮苷外，還有其他的一些雜質(zhì)存在。由于缺少對(duì)應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，尚不能確定它們是哪種物質(zhì)。這有待于以后的進(jìn)一步研究。而經(jīng)制備色譜精制后的樣品已經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)峰值基本無(wú)異，說(shuō)明制備色譜對(duì)于橙皮苷類(lèi)物質(zhì)的純化十分有效。

3 結(jié)語(yǔ)

1）采用不同類(lèi)型有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系分離純化橙皮苷粗提物，效果不同。實(shí)驗(yàn)條件下，以丙酮/K2HPO4體系效果較好。其最佳萃取條件為：K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%；室溫，pH 10，粗提物用量0.4 g。其時(shí)，相比R為1.25，分配系數(shù)K為23.36，萃取回收率96.69%。

2）丙酮/K2HPO4雙水相萃取體系對(duì)橙皮苷有一定的選擇性，可達(dá)到70%以上的純度，純化倍數(shù)達(dá)20倍以上。但其選擇專(zhuān)一性還有待進(jìn)一步研究。

3）制備型HPLC的流動(dòng)相洗脫方式對(duì)橙皮苷的分離效果有一定影響。實(shí)驗(yàn)條件下，以甲醇-水梯度洗脫方式純化效果較好。

4）丙酮/K2HPO4雙水相體系純化后的橙皮苷樣品的純度約71.36%，制備型HPLC精制所得橙皮苷干品純度可達(dá)到96.09%，且回收率較高。

5）本實(shí)驗(yàn)橙皮苷總回收率約為83.54%。

6）由丙酮/K2HPO4構(gòu)成的雙水相體系選擇性較高，K2HPO4是生物活性物質(zhì)的常用緩沖溶液用藥品，由此構(gòu)成的雙水相體系更適合于具有生物活性的天然物質(zhì)的萃取分離，值得對(duì)此作進(jìn)一步研究。

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