雍 軍

（甘肅省臨洮縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 臨洮 743000）

農(nóng)作物育種和栽培新技術(shù)的發(fā)展使產(chǎn)量發(fā)生了翻天覆地的變化，但農(nóng)作物生長環(huán)境及其相關(guān)的微生物、蟲害等經(jīng)常變化，如真菌和蟲害變異使作物失去抗性，荒漠的開墾種植改變了作物生長環(huán)境，加之消費者喜好和適口性的變化、全球人口的增長等，使作物育種者面臨新品種改良的挑戰(zhàn)。與產(chǎn)量穩(wěn)定和持續(xù)性相關(guān)的性狀將是作物育種的聚焦點，這些性狀主要包括持久抗病性、非生物耐壓性及營養(yǎng)和水分利用效率等。在育種方法上，除充分利用傳統(tǒng)育種技術(shù)改良作物產(chǎn)量外，生物技術(shù)也得到了廣泛重視。DNA標(biāo)記技術(shù)是生物技術(shù)的一個重要方面，DNA標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted Selection，MAS）會大大地提高選擇的準(zhǔn)確性和選擇效率。MAS是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個體的遺傳組成，從而實現(xiàn)對基因型的直接選擇，為抗病、豐產(chǎn)作物新品種選育注入新的活力。

1 在MAS中主要應(yīng)用的DNA標(biāo)記特點及類型

1.1 特點

在MAS中應(yīng)用DNA需要考慮5個方面，即標(biāo)記的可靠性、標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量、標(biāo)記分析的技術(shù)程序、標(biāo)記的多態(tài)性水平和標(biāo)記使用費用［1~2］。

1.1.1 標(biāo)記的可靠性 使用的標(biāo)記應(yīng)該緊密連鎖于目標(biāo)位點，遺傳距離小于5 cm，側(cè)翼或基因內(nèi)標(biāo)記的應(yīng)用會大大提高標(biāo)記預(yù)測表型的可靠性。

1.1.2 標(biāo)記的質(zhì)和量 有些標(biāo)記需要高質(zhì)量和一定數(shù)量的DNA，這種DNA在常規(guī)程序下難以獲得，這在一定程度上也提高了標(biāo)記應(yīng)用的費用。

1.1.3 標(biāo)記的技術(shù)程序 簡單化的操作程序是較為理想的，便于高通量實施，可明顯提高育種效率。

1.1.4 標(biāo)記的多態(tài)性水平 理想的標(biāo)記應(yīng)該是高多態(tài)性的，在不同基因型之間存在明顯的差別，尤其對核心育種材料更是如此。

1.1.5 標(biāo)記應(yīng)用費用 所應(yīng)用標(biāo)記的應(yīng)該是高效率、低費用，使MAS的操作性更強。

1.2 類型

簡單重復(fù)序列（SSR）或微衛(wèi)星是主要農(nóng)作物中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記方法，重復(fù)性好，共顯性、可遺傳、相對簡單便宜，且具高多態(tài)性。SSR標(biāo)記的唯一缺點是要跑聚丙烯酰胺電泳，盡管多個標(biāo)記可以同時篩選，但獲得的信息是單位點的。SSR標(biāo)記也需要一定的時間和費用，在一些孤生作物中，大量的SSR標(biāo)記構(gòu)建高密度遺傳圖譜也是不可行的。序列標(biāo)簽位點（STS）、序列特征擴增區(qū)域（SCAR）、單個核苷酸多態(tài)性（SNP）均來自特異性DNA標(biāo)記序列（如RFLP），連鎖于相關(guān)性狀基因和數(shù)量性狀（QTL），在MAS中應(yīng)用極端有效［3~5］。

2 MAS成功應(yīng)用的前提條件

作物相關(guān)性狀特異高效分子標(biāo)記是MAS操作的關(guān)鍵基礎(chǔ)。MAS成功與否主要決定于準(zhǔn)確定位QTL/主效基因的多態(tài)性標(biāo)記遺傳圖譜、標(biāo)記與QTL/基因間的緊密連鎖程度、標(biāo)記和基因組間有一定的重組率等［6］。MAS涉及基因輔助選擇（包括利用標(biāo)記定位目標(biāo)基因的位置，尋找最友好型環(huán)境）、連鎖不平衡MAS和連鎖平衡MAS，后者是植物MAS中最富挑戰(zhàn)性的。MAS的最終目標(biāo)是尋找最感興趣的等位變異基因和從分離群體中選擇最理想的個體，這些個體以植物部分或全基因組等位組成為基礎(chǔ)。

連鎖于基因和QTL的眾多DNA標(biāo)記被報道［7］。從前認(rèn)為來自初步定位的QTL標(biāo)記可以直接應(yīng)用于MAS，近年來認(rèn)為初步定位的QTL的進一步肯定、驗證和精細(xì)定位是有必要的［8］。雖然有一些例子證實有些初步定位的QTL標(biāo)記是準(zhǔn)確的，但因受諸多因素如取樣的偏差等，QTL的位置和效應(yīng)是不準(zhǔn)確的［9］，理想的QTL驗證是必要的。QTL的驗證是指確認(rèn)QTL在不同遺傳背景下是有效的［8］，另外的標(biāo)記實驗是指在10 cm的窗口跨度間或QTL側(cè)翼（在不同基因型中單個標(biāo)記的多態(tài)性很有限）的標(biāo)記工具箱或組合鑒定的涉入或把現(xiàn)有標(biāo)記轉(zhuǎn)化成為更為簡單的鑒定方法。一旦一個與可靠性表型性狀緊密連鎖的標(biāo)記被鑒定，這個標(biāo)記就可應(yīng)用于MAS。

但MAS的成功與否，也需要大田育種者和分子標(biāo)記應(yīng)用者相互了解溝通，最終默契合作。作物新品種選育涉及分子生物學(xué)、作物育種學(xué)、生物學(xué)和田間選種經(jīng)驗等知識，只有將其中涉及的各個環(huán)節(jié)和問題妥善解決，熟練操作MAS實驗室技術(shù)和了解田間理想農(nóng)藝性狀植株選擇標(biāo)準(zhǔn)非常有必要，也是MAS和傳統(tǒng)育種結(jié)合培育優(yōu)良農(nóng)作物新品種的重要保證。

3 MAS選擇的基本優(yōu)勢

傳統(tǒng)作物育種主要基于雜交分離后代優(yōu)良個體的表型選擇，育種時間長（育成1個新品種，需要8～12 a的時間），而且也存在一定的缺陷，如基于表型選擇方法，部分目標(biāo)個體在多代選擇中易于丟失，選擇的盲目性較大，效率低；有些新品系往往在選育期間淘汰，新品系的推廣難以保證。如抗條銹病小麥新品種的選育，從親本的選擇到一個新品系的獲得，需要8 a以上的時間，最初抗病的材料因條銹菌生理小種變異，使其失去抗性而在推廣之前已失去利用價值。有些性狀難以通過表型性狀選擇，如選育材料的品質(zhì)（面筋強度、顏色和質(zhì)地等），只有通過一定的化學(xué)實驗才能確定其品質(zhì)優(yōu)劣。隱性基因控制的性狀，即使純合基因型材料在田間辨認(rèn)也存在一定的難度。因此，育種家極端感興趣使選擇過程高效化的新技術(shù)，并對MAS成為加速作物后代選擇的有效工具已達(dá)成共識。

MAS比傳統(tǒng)表型選擇更直接，且節(jié)省時間和資源。在小麥抗蟲育種中難以度量的典型性狀是孢囊線蟲和根結(jié)線蟲的抗性［10～11］，其次就是品質(zhì)性狀，需要昂貴的篩選程序。MAS選擇能在苗期進行，尤其是對于生殖階段表達(dá)的農(nóng)藝性狀非常有用，通過苗期選擇對不想要的基因型可以盡早淘汰，縮小后代群體的規(guī)模。如水稻先育苗，后移栽在稻田，可利用分子標(biāo)記對水稻的抗病性等性狀進行分析，以淘汰不理想的個體，對水稻進行選擇性移栽等。MAS還被應(yīng)用于單株選擇。應(yīng)用傳統(tǒng)選擇方法選擇大部分性狀，由于受環(huán)境影響單株的選擇是不可靠的，植株性狀是建立在基因型基礎(chǔ)上，通過MAS可以選擇單株，而傳統(tǒng)選擇方法對純合體和雜合體不能區(qū)分。

以上MAS的優(yōu)勢能被育種工作者利用，可加快育種進程，目標(biāo)基因型能被高效選擇，有些性狀能被快速跟蹤，促進品系快速發(fā)展和推廣［12］。標(biāo)記輔助選擇可作為表型選擇的替代品應(yīng)用，允許在淡季進行選種圃的選擇，使選擇更為高效，每年度可種植多代［13］。MAS的另一優(yōu)點是縮小試驗材料的群體規(guī)模，MAS選擇后淘汰一部分材料，使小規(guī)模的溫室或田間試驗成為可能?？紤]到MAS的優(yōu)勢明顯超過傳統(tǒng)育種，幾乎不會有人討論標(biāo)記不必要應(yīng)用或更為有效，盡管標(biāo)記在時間、經(jīng)費和資源上需要可觀的投入。對許多性狀已經(jīng)存在有效的表性選擇，而且大群體選擇花費較少，而當(dāng)進行全基因組掃描、遺傳控制被了解時，這些性狀也能被選擇。

4 MAS在作物育種中的應(yīng)用狀況及限制因素

4.1 MAS在作物育種中的應(yīng)用狀況

隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展，MAS在作物育種中的應(yīng)用和成效更為明顯。DNA標(biāo)記在作物育種中的應(yīng)用途徑主要涉及種質(zhì)資源的鑒定評價、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位和輔助選擇、目標(biāo)基因回交輔助選擇、基因聚合、野生種基因轉(zhuǎn)移跟蹤、早代選擇等方面。MAS應(yīng)用的一個早期例子是Rakszegi等成功的從匈牙利品種Bankuti1201中將谷蛋白基因轉(zhuǎn)入一個新品系［14］?；亟挥N中成功的一個例子是將野生種抗病單基因轉(zhuǎn)入栽培種，目的是減少連鎖累贅［15］。另一個例子在印度和尼泊爾利用分子標(biāo)記輔助選擇改良雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)水稻品種的耐旱性［16］。因科學(xué)、社會和經(jīng)濟等因素的限制，不同國家不同作物對MAS的應(yīng)用程度不同［17］。應(yīng)用水平與國家的經(jīng)濟實力有一定的關(guān)系，而與項目支持力度、基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)技術(shù)人員的比例直接關(guān)聯(lián)。低水平經(jīng)濟國家仍然維持于常規(guī)育種階段，高水平經(jīng)濟國家的情況也不盡相同。不同作物之間MAS的應(yīng)用也存在很大的差異，水稻、玉米和小麥中應(yīng)用較為廣泛，而熱帶作物、豆類和小米等應(yīng)用較為有限。

4.2 MAS在作物育種中的限制因素

MAS的應(yīng)用受多方面因素影響，但必須要強調(diào)的是除了有效的科學(xué)和經(jīng)濟因素延誤和阻止MAS的發(fā)展外，人力資源和重要農(nóng)藝性狀標(biāo)記的有效性在一定程度上也限制了MAS的快速應(yīng)用。分子育種工作者和常規(guī)育種人員之間缺乏交流，相互不了解和熟悉其工作的必要性，導(dǎo)致具備條件的單位不需要進行MAS操作，而專門進行基礎(chǔ)研究；需要進行MAS技術(shù)的單位，不了解相應(yīng)的標(biāo)記應(yīng)用程序，且缺少進行MAS操作的相關(guān)儀器設(shè)施。另外，農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀標(biāo)記的數(shù)量和有效性阻止了MAS的快速發(fā)展，如正式命名的小麥抗條銹病基因/QTL標(biāo)記已超過53/135個［18］，除Yr18、Yr9、Yr26等基因的連鎖標(biāo)記，可應(yīng)用于相應(yīng)基因的輔助選擇外，其余基因的標(biāo)記很難在其輔助選擇中應(yīng)用。直到目前為止，盡管MAS在品種發(fā)展方面的沖擊較小，但MAS的選擇效率和潛力，品系的選育采用常規(guī)育種與MAS相結(jié)合，以分子標(biāo)記選擇代替表型選擇或結(jié)合表型選擇是今后作物育種的趨勢。

5 結(jié)語

相對于傳統(tǒng)育種，MAS優(yōu)勢很明顯，MAS能極大地提高作物育種效率，但MAS與育種程序結(jié)合是必須的，需要強調(diào)的是MAS始終只能是育種的輔助選擇手段。作物相關(guān)性狀特異高效分子標(biāo)記是其MAS操作的關(guān)鍵基礎(chǔ)，MAS成功與否主要決定于相關(guān)性狀QTL/主效基因的多態(tài)性標(biāo)記在不同遺傳背景材料中的可重復(fù)性、操作技術(shù)的熟練程度等。到目前為止，MAS在品種發(fā)展方面的作用較小。將重要分子標(biāo)記輔助選擇計劃列入育種日程，可加快優(yōu)異農(nóng)作物新品種選育進程，提高育種效率。

［1］ WITCOMBE JR.VIRK D S.Number of crosses and population size for participatory and classical plant breeding［J］.Euphytica，2001，122：451-462.

［2］ MOHLER V.SINGRUN C.General considerations：marker-assisted selection：Molecular marker systems（eds H.Lorz&G.Wenzel），［J］.Biotechnology in agriculture and forestry，2004，55：305-317.

［3］ SHAN X，BLAKE T K，TALBERT L E.Conversion of AFLPmarkers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat［J］.Theor.Appl.Genet， 1999，98：1072-1078.

［4］ SANCHEZ A C，BRA，D S，HUANG N，et al.Sequence tagged site marker-assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice［J］.Crop Sci.，2000，40：792-797.

［5］ SHARP P J.Validation of molecular markers for wheat breeding ［J］.Aust.J.Agric.Res.，2001，52：1357-1366.

［6］ IBITOYE D O，P E AKIN-IDOWU.Marker-assistedselection（MAS）：A fast track to increase genetic gain in orticultural crop breeding［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（52）：8889-8895.

［7］ FRANCIA E， TACCONI G， CROSATTI C， et al.Marker assisted selection in crop plants［J］.Plant Cell Tissue Org.，2005，82：317-342.

［8］ LANGRIDGE P，LAGUDAH E，HOLTON T，et al.Trends in genetic and genome analyses in wheat：a review［J］.Aust.J.Agric.Res.， 2001，52：1043-1077.

［9］ MELCHINGER A E，UTZH F，SCHON CC.Quantitative trait locus（QTL） mapping using different testers and independent population samples in maize reveals low power of QTL detection and large bias in estimates of QTL effects［J］.Genetics，1998，149：383-403.

［10］ EAGLESH，BARIANA H，OGBONNAYA F，et al..Implementation ofmarkers in Australian wheat breeding［J］.Aust.J.Agric.Res.， 2001，52：1349-1356.

［11］ ZWARTR S，THOMPSON JP，GODWIN ID.Genetic analysis of resistance to root-lesion nematode（Pratylenchus thornei）in wheat［J］.Plant Breed，2004，123：209-212.

［12］ Morris M，Dreher K，Ribaut J.et al.Money matters（II）：costs ofmaize inbred line conversion schemes at CIMMYT using conventional and markerassisted selection［J］.Mol.Breed，2003，11：235-247.

［13］ RIBAUT JM，HOISINGTON D.Marker-assisted selection：new tools and strategies［J］.Trends Plant Sci.，1998，3：236-239.

［14］ RAKSZEGIM，LA'NG L，BEDO Z.Development of wheat genotypes for organic farming using classical and molecularmarkerassisted selection techniques（o¨kolo'giai gazda'lkoda'sra alkalmas bu'za genotl'pusok szelekcio'ja molekula'rias e's hagyoma'nyos nemesl'te'ssel）.In：Bedo Z，Kova'cs G （eds） Organic breeding and farming of cereals［M］.Hungarian： Agroinform Publishing House，2006：79-85.

［15］ WERNER K，F(xiàn)RIEDT W，ORDON F.Strategies for pyramiding resistance genes against the barley yellow mosaic virus complex(BaMMV，BaYMV，BaYMV-2)［J］.Mol.Breed ，2005，16：45-55

［16］ STEELE KA，VIRK DS，PRASAD SC，et al.Combining PPB and markerassisted selection：strategies and experienceswith rice［J］.Crop Sci.，2004，44：1560-1571.

［17］ RIBAUT JM，MC DE VICENTE，X DELANNAY.Molecular breeding in developing countries：challenges and perspectives［J］.Plant Biology， 2010，13：1-6.

［18］ 任 妍.普通小麥抗條銹病基因分子定位［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.