霍順校

（平鄉(xiāng)職教中心，河北 邢臺 054000）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，畜禽的飼養(yǎng)密度高度集中，調(diào)動也越來越頻繁。再加上多年來畜禽品種在選育上偏重生產(chǎn)性能的提高，忽視了動物機體抗病性能的保持與加強。結(jié)果養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化，動物機體抗病力逐漸減弱，致使病害頻繁發(fā)生。尤其是一些發(fā)病率高、死亡率高的流行病的爆發(fā)，經(jīng)常會給局部地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊。因此加強對病害防治技術(shù)的研究，已成為推動我國養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。近年來，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在防治最突出的畜禽疫病的方面取得了一定的成就。目前分子生物學(xué)技術(shù)在我國畜禽疫病防治中應(yīng)用，主要在畜禽疫病診斷和新型畜禽疫苗研究兩個方面。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在畜禽疫病診斷中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的畜禽疫病的診斷主要依據(jù)肉眼觀察、癥狀判別、顯微鏡檢查、微生物培養(yǎng)、表型分析、血清學(xué)分析、病理切片觀察等方法。但是這些方法的診斷時程較長，而有些畜禽疫病的發(fā)展迅速，由于不能及時治療給生產(chǎn)造成重大損失。而分子生物學(xué)技術(shù)在診斷畜禽疫病時，可以為微生物病原體的鑒定提供快捷、精確的方法。目前在我國畜禽疫病診斷中常用分子生物學(xué)技術(shù)主要有以下幾種。

1.1 PCR 技術(shù)

PCR 技術(shù)是一項體外擴增DNA 的分子生物學(xué)新技術(shù)。與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)如生物化學(xué)、細菌學(xué)病毒學(xué)和血清學(xué)方法相比，PCR 技術(shù)具有快速、敏感、簡單、特異性強的優(yōu)點。它在畜禽疫病診斷中主要用于那些培養(yǎng)困難的細菌和抗原性復(fù)雜的細菌檢測鑒定。它可以通過從基因中篩選某菌的特異性雜交片段來鑒定細菌。張嘉寧等采用酚提取法和裂解法制備了沙門氏菌的PCR 模版和PCR 診斷試劑盒，檢測結(jié)果的陽性率比培養(yǎng)法高，且整個過程僅需6～8h。[1]此外對于嚴(yán)格厭氧菌如結(jié)節(jié)雙枝桿菌、分離困難的支原體等，運用PCR 技術(shù)也很容易檢測，并且節(jié)約時間，靈敏度也高。謝芝勛等建立了檢測鑒別火雞支原體的PCR 技術(shù)，用該PCR 技術(shù)能檢測出100fg 的火雞支原體DNA 模版。[2]PCR 技術(shù)不僅可以用于細菌、支原體等微生物的檢測，并且可以用于病毒的檢測，尤其是那些難以進行培養(yǎng)和血清學(xué)檢測的病毒。劉加波等用PCR 技術(shù)對雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）進行了敏感試驗，結(jié)果可以檢測出10pg 的ILTV－DNA，表明該PCR 技術(shù)有很高的靈敏度。[3]

1.2 基因探針

基因探針又稱核酸探針，是指能識別特異堿基序列的有標(biāo)記的一段單鏈DNA 或RNA 分子，即一段與被測定的核苷酸序列互補的帶有標(biāo)記的單股核苷酸。在畜禽疫病診斷中具有快速、簡便、敏感的特點。只要得到病原體的基因序列，就可以在實驗室合成特異性十分準(zhǔn)確的探針。近年來，隨著寡核核苷酸合成快速發(fā)展，越來越多的各種病原體的序列已被測定，因而有可能從這些序列中，篩選出共同的保守序列，然后合成某種光譜特異探針供實際檢測應(yīng)用。張訓(xùn)海等選用馬立克氏病病毒（MDV）GA株BamHI 基因文庫中LDNA 片段，制成DIG-標(biāo)記的MDV 核酸探針，分別對Ⅰ型MDV 強毒株（BJ-1株）和弱毒株（Md11/75c株）感染材料的核酸進行dotblot 雜交檢測，結(jié)果顯示均有陽性呈色反應(yīng)。[4]王蕾等用地高辛標(biāo)記禽呼腸孤病毒（ARV）SL 基因中編碼σC 蛋白的基因片段作為核酸探針，在斑點分子雜交中可檢測到1.6 pgARV 的RNA。試驗結(jié)果表明研究建立的核酸探針檢測方法靈敏度高、特異性強和操作簡便，適于批量樣品的檢測。[5]

1.3 基因芯片

基因芯片又稱DNA 微陣列芯片、DNA 微陣列、DNA 芯片，其技術(shù)雛形是Southern blot 技術(shù)，是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段。它的制作方法是首先在固相支持無（通常是硅化玻璃）上原位合成寡核苷酸或直接將大量預(yù)先制備的DNA 探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，將未互補結(jié)合反應(yīng)的片段洗去，通過雜交信號的檢測分析得到樣品的遺傳信息?；蛐酒夹g(shù)不僅可以在DNA 水平上尋找和檢測與疾病相關(guān)的內(nèi)源基因及外源基因，而且可以在RNA 水平上檢測致病基因的異常表達，從而對某些疾病作出檢測，對病原體的抗藥性作出判斷，具有高親和性、高精確性、高靈敏性、操作簡便、結(jié)果客觀性強的優(yōu)點。[6,7]朱來華等通過分子克隆技術(shù)獲得馬皰疹病毒1型(EHV1)、馬動脈炎病毒 (EAV)、馬流感病毒 (EIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和東部馬腦脊髓炎病毒(EEEV)等5種病毒各一段高度保守的特異性基因片段，用芯片點樣儀逐點分配到處理過的玻片上，制備成檢測芯片。提取樣品中的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄和熒光標(biāo)記后滴加到芯片上進行特異性雜交，對雜交結(jié)果進行掃描檢測和計算機軟件分析。結(jié)果顯示，制備的基因芯片可同時檢測和鑒別上述5種病毒，可檢測到陽性雜交信號的最高稀釋度為10-6的病毒液，約25個病毒DNA 拷貝，但其他病毒材料未見紅色熒光信號，證明了制備的基因芯片的具有特異性。[8]

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是固相吸附技術(shù)和免疫酶技術(shù)相結(jié)合的一種方法，是免疫學(xué)診斷中的一項新技術(shù)。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標(biāo)記。固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。[9，10]因其具有特異性高、敏感性強、穩(wěn)定性好、易于檢測、結(jié)果可靠等特點，應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫學(xué)診斷，也應(yīng)用于分子抗原和抗體的測定，其應(yīng)用范圍日益擴大，逐漸成為檢測技術(shù)的主流。王海震等建立了檢測豬瘟血清抗體水平的間接ELISA 方法。對收集的約120頭份血清樣品進行檢測,結(jié)果顯示該方法因具有較高的特異性和靈敏度高,同時克服了以往檢測豬瘟抗體水平所用抗原為完整的病毒粒子，豬瘟病毒不易培養(yǎng)，滴度低，難于純化等缺點。[11]李海燕等建立了禽流感間接酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷技術(shù)（rNP-ELISA）。經(jīng)試驗證明，rNP-ELISA 是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快速、經(jīng)濟的血清學(xué)診斷技術(shù)。其并將成熟的禽流感間接ELISA 快速診斷技術(shù)試劑盒化，該試劑盒與進口禽流感間接ELISA診斷試劑盒對同樣血清樣品檢測，符合率為100%。[12,13]張國中等使用傳染性喉氣管炎 (ILT)抗體檢測ELISA 試劑盒對已知來源的自制陽性血清、免疫血清以及SPF 陰性血清進行了ILT 抗體檢測,研究結(jié)果表明該試劑盒具有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性,與瓊脂凝膠免疫擴散試驗方法（AGP）相比,ELISA方法具有更高的敏感性,AGP 大約只能檢出相對于ELISA 方法78.6%的陽性樣。[14]

1.5 免疫熒光試驗

免疫熒光試驗是預(yù)先將熒光素標(biāo)記在抗體上，再與涂片、切片或細胞懸液中的抗原進行反應(yīng)，借助熒光顯微鏡觀察是否有熒光素的熒光，判斷是否存在相應(yīng)的抗原并確定其相應(yīng)的位置。免疫熒光試驗是目前國內(nèi)外實驗室診斷畜禽傳染病的常用方法，結(jié)果直觀、可靠。特別是在疫情初期必須查清病源，檢疫及凈化養(yǎng)殖場病原時，此種檢測方法尤為重要。袁婧等以臨床“高熱綜合征”病例中分離的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)HBR 變異株接種試驗豬制備抗血清，采用硫酸銨鹽析法提取血清中免疫球蛋白 (IgG)，并用異硫氰酸熒光素(FITC)對IgG 進行熒光標(biāo)記，建立了一種直接免疫熒光診斷方法(FA)，對臨床10個豬場送檢的38份病料平均陽性檢出率為63．2%(24/38)。與RT-PCR檢測結(jié)果符合率為96．3%，對幾種已知豬病毒抗原無交叉反應(yīng)。表明該方法具有特異性強、敏感性和重復(fù)性好等特點，F(xiàn)A 為PRRS 的臨床診斷提供了一種快速、便捷、敏感、特異的檢測方法。[15]

1.6 膠體金快速診斷技術(shù)

膠體金快速診斷技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)。其基本原理是：以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣本后，經(jīng)微孔膜的滲濾作用或毛細管虹吸作用，使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物與之反應(yīng)形成紅色的可見結(jié)果。由于其快速、便捷、不需特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀，近年來越來越受到人們的重視，其技術(shù)發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。目前在獸醫(yī)臨床診斷中也研制了許多種檢測試劑盒，李蓓蓓等采用膠體金同時標(biāo)記新城疫單克隆抗體和禽流感單克隆抗體制備復(fù)合型膠體金免疫試紙條可同時檢測兩種病毒。試紙條檢測新城疫病毒的靈敏度比血凝試驗結(jié)果高8倍。[16]張書環(huán)等利用膠體金免疫層析技術(shù)原理，用原核誘導(dǎo)表達的牛分支桿菌抗原蛋白MPB83 和MPB70 分別作為膠體金標(biāo)記抗原和檢測線上的捕獲抗原，制備牛結(jié)核抗體檢測試紙條。并與細菌分離培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(TST)和韓國試紙條比較。試紙條與牛分支桿菌分離培養(yǎng)的符合率為85%，與TST 的符合率為79.73%，與韓國試紙條的符合率為98.75%。[17]金顏輝等進行了應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)檢測豬瘟抗體的研究，用膠體金標(biāo)免疫層析技術(shù)檢測30份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和18份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，結(jié)果檢測陽性、陰性符合率100%。[18]這些試驗結(jié)果表明膠體金免疫層析試紙條具有敏感、特異、簡便、快速的特點。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在新型畜禽疫苗研制中的應(yīng)用

由于病原體的強毒株和變異毒株的出現(xiàn)，用傳統(tǒng)疫苗接種難以起到很好的免疫保護作用，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。為了更準(zhǔn)確地預(yù)防控制這些疫病，根據(jù)各種疫病流行特點和免疫機理研制出安全有效的新疫苗。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的一批新疫苗開始被研制出來并逐漸應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，這些以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的新畜禽疫苗主要有以下幾種。

2.1 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗又稱生物合成亞單位疫苗或基因工程亞單位疫苗，只含有病原體的一種或幾種抗原,而不含有病原體的其他遺傳信息。能利用體外表達系統(tǒng)(如大腸埃希氏菌、桿狀病毒、酵母等)大量表達病毒的主要保護性抗原蛋白作為免疫原。在研制亞單位疫苗時,首先要明確編碼具有免疫原活性的目的DNA 片段,將具有免疫原性的抗原決定簇的基因編碼片段插入到合適的表達質(zhì)粒中，并使其在病毒、細菌、酵母、昆蟲細胞中高效穩(wěn)定表達，以基因工程技術(shù)生產(chǎn)大量抗原，從而制備成只含免疫原性的亞單位疫苗。該類疫苗不含致病因子的核酸成分，因此具有良好的安全性,且便于規(guī)模化生產(chǎn)。姬向波等構(gòu)建了編碼雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）主要抗原gB 基因的重組DNA 疫苗pcDNA-gB，將其與他們保存的重組雞痘病毒rFPV-gB-gD-IgY 分別以單獨和混合的方式給4周齡非免疫雞進行免疫，然后測定ILTV 特異性抗體和T 淋巴細胞增殖反應(yīng)。結(jié)果表明這2種基因工程疫苗均能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生特異性的體液免疫及細胞免疫應(yīng)答，該研究結(jié)果為ILTV 新型疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。[19]付玉潔等采用豬圓環(huán)病毒PCV2a-LG株和PCV2b．YJ株制備了2種病毒滅活疫苗，及其重組桿狀病毒表達的2種Cap 蛋白(PCV2a-rCap 和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。選用8周齡BALB/c 鼠165只，隨機分成11 組，每組15只，用上述4種疫苗各免疫2 組，以PCV2a或PCV2b株攻毒。攻毒后，采用免疫過氧化物酶單層細胞試驗方法。檢測抗體，其中PCV2a．rCap 免疫組抗體效價最高。[20]

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗(Synthetical peptide vaccine)也稱表位疫苗(Epitope vaccine),應(yīng)用計算機軟件分析和生物信息學(xué)技術(shù)，從蛋白的一級結(jié)構(gòu)結(jié)合單克隆抗體分析等技術(shù)可以推導(dǎo)出該蛋白的主要表位，并用化學(xué)方法合成這一類似于抗原決定簇的多肽（20～40個氨基酸）作為抗原。合成肽疫苗分子是由多個B細胞抗原表位和T 細胞抗原表位共同組成的,大多需與一個載體骨架分子相耦聯(lián)。它們的特點是純度高、穩(wěn)定。由于它只能線性表達，不能折疊，因此只適應(yīng)于線性病毒病。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)合成肽疫苗,主要集中在FMDV 的單獨B 細胞抗原表位或與T 細胞抗原表位結(jié)合而制備的合成肽疫苗研究。趙凱等以豬自體免疫球蛋白IgG的H 鏈作為外源抗原載體制備合成口蹄疫肽疫苗，對豚鼠、豬等起到了保護作用。[21]劉明秋等根據(jù)A型口蹄疫病毒(FMDv)的VP1 基因序列及國際上公認(rèn)的抗病毒中和表位，并結(jié)合對151 蹄疫病毒的研究成果，設(shè)計了A型FMDV 的重組多肽疫苗,體外免疫原性檢測表明，該融和蛋白具有免疫反應(yīng)性,免疫豚鼠的實驗結(jié)果表明，融合蛋白能在豚鼠體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體，并使70%的豚鼠能抵抗病毒的攻擊。[22]

2.3 基因缺失疫苗

病毒編碼毒力的基因可以刪除，當(dāng)某些與病毒復(fù)制無關(guān)的毒力基因缺失突變后，病毒毒力喪失或明顯減弱，但病毒復(fù)制能力并不喪失，同時還保持著良好的免疫原性?；蛉笔б呙缡抢弥亟M技術(shù)敲除表達毒力因子的特異基因獲得的基因缺失弱毒疫苗株，病原性與致病力減弱，降低了對宿主組織侵害。其突出的優(yōu)點是疫苗毒力不會返強而免疫原性不發(fā)生變化，免疫期長等，因而是較理想的疫苗。何啟蓋等用雞胚成纖維細胞擴大培養(yǎng)了PrV HB－98 突變株(TK－/gG－/LacZ＋),研制了偽狂犬病基因缺失疫苗,并對該疫苗經(jīng)肌肉接種、經(jīng)口等免疫途徑的最小免疫劑量進行了測定,田間試驗表明,4 批豬偽狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔豬發(fā)病時的緊急接種。為豬偽狂犬病基因工程疫苗的制備與應(yīng)用提供了有力的依據(jù)。[23]康凱等通過基因同源重組技術(shù)，利用高效自殺性載體系統(tǒng)，敲除雞白痢沙門氏菌 (S.pullorum)CVCC 79201株的rfaH 基因，同時未引入任何抗生素抗性基因等外源DNA序列，經(jīng)篩選獲得重組S.pullorum(rSp)株。動物試驗結(jié)果表明，rSp 免疫伊莎褐蛋雞后，其抗血清可通過平板凝集試驗與CVCC 79201 免疫的血清相區(qū)分，為S.pullorum 缺失疫苗的研制提供了技術(shù)平臺。[24]

2.4 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是以病毒或細菌為載體通過基因工程的方法使之表達某種特定病原物的抗原決定簇基因,從而產(chǎn)生免疫原性。也可以是致病性微生物通過基因工程的方法修飾或去掉毒性基因,但仍保持免疫原性。制成的重組活載體疫苗可同時啟動機體細胞免疫和體液免疫，克服了亞單位疫苗和滅活疫苗的不足，同時也不存在毒力返強的問題。另一最大優(yōu)點是活載體疫苗可以同時表達多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，既解決了現(xiàn)有多聯(lián)疫苗的制造工藝難題，又能一針防多病。賈立軍等以鵝源H5亞型禽流感病毒（AVI）基因組為模板，用RT－PCR 擴增血凝素（hemagglutinin）基因，克隆入雞痘病毒表達載體Pfg1175，轉(zhuǎn)染雞痘病毒感染的雞胚成纖維細胞，通過藍斑篩選和間接免疫熒光檢測，獲得表達HA 基因的重組雞痘病毒,免疫試驗結(jié)果表明，構(gòu)建了表達HA 基因的重組雞痘病毒，該重組病毒具有良好遺傳穩(wěn)定性，免疫雞可提供完全保護，顯示出了一定的應(yīng)用前景。[25]馬嗚瀟等成功的篩選到了一株攜有了口蹄疫病毒（FMDV）多表位基因的重組雞痘病毒rFPV－OAAT－IL18。通過RT－PCR 和IFA 檢測表明，相應(yīng)的目的基因在重組病毒中獲得了表達，這為新型FMDV 疫苗研究提供了新思路。[26]

2.5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是利用分子生物學(xué)技術(shù),將病原微生物的抗原編碼基因?qū)胫参?并在植物中表達出活性蛋白,人或動物食用含有該種抗原的轉(zhuǎn)基因植物,激發(fā)腸道免疫系統(tǒng),從而產(chǎn)生對病毒、寄生蟲等病原菌的免疫能力。轉(zhuǎn)基因植物疫苗實際上是重組DNA 疫苗的一種，但是由于生產(chǎn)疫苗的系統(tǒng)由大腸桿菌和酵母菌換成了高等植物，有的植物是可以生食的，例如黃瓜、胡蘿卜和番茄等，有的植物可以作為飼料，如玉米、大豆等，合適的抗原基因只要在該植物可食用部位的器官特異表達的啟動子的驅(qū)動下，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植物即可直接用于畜禽的口服免疫。轉(zhuǎn)基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接種方便等優(yōu)點。潘麗等構(gòu)建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1 基因的植物雙元表達載體pBin438/VP1。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把口蹄疫病毒VP1 基因整合到番茄基因組獲得轉(zhuǎn)基因番茄，三次免疫豚鼠后21d 血清效價最高可達1∶64，攻毒后兩組免疫豚鼠保護率分別達80%和40%，證明轉(zhuǎn)基因番茄表達的VP1 蛋白具有良好的免疫原性。[27]余云舟等在構(gòu)建口蹄疫病毒（FMDV）結(jié)構(gòu)蛋白P1 基因植物雙元表達載體的基礎(chǔ)上，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化玉米共獲得了13株轉(zhuǎn)基因玉米植株，為利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)FMDV 基因工程疫苗進行了探索性基礎(chǔ)研究。[28]王煒等以豆科牧草百脈根為轉(zhuǎn)化受體，將口蹄疫病毒P12A－3C 基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入百脈根基因組。對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR、RT－PCR 檢測，表明口蹄疫病毒P12A－3C 基因整合在植物染色體基因組，并且具有轉(zhuǎn)錄活性，ELISA 檢測表明，轉(zhuǎn)基因植株能夠表達出口蹄疫病毒P12A－3C 基因的目的蛋白。[29]

2.6 核酸疫苗

核酸疫苗也稱基因疫苗或DNA 疫苗，是隨著基因治療而發(fā)展起來的第三代疫苗。它是將外源病原的一種或多種保護性抗原基因與細菌的DNA 或病毒的DNA 連接后直接導(dǎo)入動物體內(nèi)，在機體內(nèi)表達相應(yīng)抗原，誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對相應(yīng)抗原的免疫保護作用。核酸疫苗有許多優(yōu)點，如：制造簡便、生產(chǎn)速度快、成本低、容易控制質(zhì)量、免疫期長、熱穩(wěn)定性好、便于貯藏和運輸，能同時刺激B 細胞產(chǎn)生體液免疫、刺激T 細胞產(chǎn)生細胞，無感染因子等。張丹等成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pV ·H5 ·H7,試驗證明它在體外可有效進行共表達,具有良好的免疫原性。免疫小鼠后,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答,與單獨表達H5HA 和H7HA1 的重組質(zhì)粒產(chǎn)生的應(yīng)答指標(biāo)差異不顯著(P＞0.05),免疫組均顯著高于對照組(P＜0.05),結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pV ·H5 ·H7 具有較高的表達水平。[30]沈國順等將豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF5、ORF3 基因插入真核表達載體pVAX1、pVIR－IL－l8的CMV 啟動子下游,構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pVAX1－ORF5－ORF3 和 pVIR－IL－l8－ORF5－ORF3, 進行BALB/c 小鼠免疫試驗,檢測出 pVIR－IL－l8－ORF5－ORF3 免疫組的小鼠的ELISA 抗體水平高于pVAX1－ORF5－ORF3 和 PRRS 滅活苗免疫組,CD8＋T 淋巴細胞亞群數(shù)量顯著高于pVAX1－ORF5－ORF3 和PRRS 滅活苗組,表明IL－18 核酸疫苗對豬的細胞免疫功能具有明顯的促進作用。[31]

3 結(jié)語

分子生物學(xué)技術(shù)在畜禽疫病防治中的應(yīng)用,為畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了革命性的變化?？焖贉?zhǔn)確的病原體檢測手段,高效免疫疫苗的制備都在很大程度上緩解了病害所帶來的嚴(yán)重?fù)p失。然而分子生物學(xué)技術(shù)也不是完美的,各種方法都還或多或少存在一些缺點,如PCR 擴增偏嗜性、嵌合現(xiàn)象,以及提取的微生物總DNA 不具代表性，并且目前的分子實驗主要是應(yīng)用于基礎(chǔ)性的研究,分子生物學(xué)技術(shù)要真正的應(yīng)用于生產(chǎn),還有待于優(yōu)化檢測條件,簡化儀器設(shè)備以及降低昂貴的實驗成本。近幾年來,我國在畜禽疫病防治上取得了一定程度的進展,但要進一步深入地解決病害問題,重點還應(yīng)該放在免疫防護、病害的預(yù)測和預(yù)報以及健康養(yǎng)殖模式的建立上。目前我國的畜禽養(yǎng)殖業(yè)得到了政府極大的重視,資金投入力度不斷加大,相信將會有越來越多的更高水平的分子生物學(xué)技術(shù)投入到畜禽疫病防治研究中去,從而進一步推動我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)取得更大的發(fā)展和進步。

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