劉麗,付亞磊,沈方臻,宋金霞,姚如永

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科,山東青島 266003; 2 青島市婦女兒童醫(yī)院乳腺科; 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響

劉麗1,付亞磊2,沈方臻1,宋金霞1,姚如永3

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科,山東青島 266003; 2 青島市婦女兒童醫(yī)院乳腺科; 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

目的觀察環(huán)氧合酶-2(COX-2)選擇性抑制劑塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響。方法取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞,分別加入不同濃度的單藥吉西他濱、單藥塞來昔布、塞來昔布聯(lián)合吉西他濱進(jìn)行培養(yǎng),觀察SW1990細(xì)胞增殖抑制情況及CD133m RNA、表面分子CD133表達(dá)變化。結(jié)果不同濃度塞來昔布與吉西他濱(0.500μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用,對SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯,與0.500μmol/L吉西他濱組比較,差異均有顯著性(F＝339.28～967.22,q＝4.48～36.76,P＜0.05),與對應(yīng)劑量的塞來昔布組比較,差異亦均有顯著性(q＝16.24～66.23,P＜0.05)。不同濃度塞來昔布組胰腺癌細(xì)胞株SW1990 CD133m RNA的表達(dá)較對照組明顯下調(diào)(F＝51.84～625.80,q＝14.39～45.03,P＜0.05),聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布與吉西他濱(0.500μmol/L)時(shí),其下調(diào)作用較各濃度單藥塞來昔布減弱,差異有顯著性(q＝2.85～7.75,P＜0.05)。結(jié)論塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990的增殖有抑制作用,且與吉西他濱有協(xié)同作用;塞來昔布可顯著下調(diào)SW1990細(xì)胞株干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133m RNA的表達(dá)。

胰腺腫瘤;腫瘤干細(xì)胞;塞來昔布;吉西他濱;CD133

胰腺癌是一種預(yù)后極差的惡性腫瘤,其手術(shù)切除率低且術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,對放、化療均不敏感,即使早期診斷,病人5年的生存率不到5%,中位生存期僅為4～6個(gè)月[1]。胰腺癌一線化療藥物吉西他濱在延長病人生存期方面取得了一些進(jìn)展,但療效仍不能令人滿意。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)理論是近年腫瘤研究的熱點(diǎn),該理論認(rèn)為,腫瘤內(nèi)部存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞,即CSCs,它具備無限增殖、多向分化、自我更新和極強(qiáng)的成瘤能力,形成腫瘤并維持腫瘤的生長,且對常規(guī)的放化療更不敏感,其可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的根源[2]。塞來昔布作為一種新型環(huán)氧合酶-2(COX-2)選擇性抑制劑,具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用。研究顯示,塞來昔布具有抑制結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌等胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及血管形成的作用[3]。本研究通過觀察塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響,旨在探討非甾體類抗炎藥物的抗腫瘤機(jī)制,為胰腺癌的靶向治療提供新的突破點(diǎn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供,L15培養(yǎng)液購自上海吉諾生物公司,胎牛血清購自上海北諾生物科技有限公司,四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司,塞來昔布購自南京德寶生化器材有限公司,PT-PCR試劑盒、Premix Ex Tap及Trizol提取液購自寶生工程(大連)有限公司,鼠抗人CDl33-PE及鼠抗人IgG-PE購自上海鑫樂生物技術(shù)有限公司,PCR引物購自上海生工生物工程有限公司,吉西他濱購自美國Lily公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌細(xì)胞株SW1990以含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的L15培養(yǎng)液在37℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng),細(xì)胞單層貼壁生長至70%～80%融合時(shí),用含EDTA的胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 SW1990細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算

取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種至96孔板,每孔5×104個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后分為3組,塞來昔布組分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞來昔布,吉西他濱組分別加入0.005、0.050、0.500、5.000、50.000μmol/L的吉西他濱,聯(lián)合組分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞來昔布聯(lián)合0.500μmol/ L的吉西他濱,每組5個(gè)復(fù)孔,各組均以不加藥物的細(xì)胞作為對照(對照組),同時(shí)設(shè)空白對照組。各組培養(yǎng)48 h后,每孔加MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液,每孔加DMSO溶液150μL,振蕩混勻,用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度值(A值),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率＝1－(實(shí)驗(yàn)組A值－空白對照組A值)∕(對照組A值－空白對照組A值)×100%。

1.4 SW1990細(xì)胞CD133mRNA檢測

取貼壁生長至70%～80%融合、狀態(tài)良好的細(xì)胞分3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,其中一組加入0.500μmol/L的吉西他濱,另一組分別加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞來昔布,最后一組分別加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞來昔布同時(shí)聯(lián)合0.500μmol/L的吉西他濱。另設(shè)不加藥物的細(xì)胞作為對照(對照組)。各組培養(yǎng)48 h。另取貼壁生長至70%～80%融合、狀態(tài)良好的細(xì)胞分3個(gè)組,均加入50.00μmol/L塞來昔布,培養(yǎng)時(shí)間分別為24、36、72 h,設(shè)不加藥物的細(xì)胞為對照組。提取以上各組細(xì)胞的總RNA,進(jìn)行PT-PCR反應(yīng)合成cDNA。PROM1(CD133)基因,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為123 bp,上游引物:5′-AAGGAGTCGGAAACTGGCAGA-3′,下游引物:5′-TCTGTGAACGCCTTGTCCTTG-3′;擴(kuò)增內(nèi)參照GAPDH,預(yù)期擴(kuò)增片段長135 bp,上游引物:5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′,下游引物:5′-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3′。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min、98℃變性10 s、58℃退火(GAPDH 60℃)30 s、72℃延伸10 min,循環(huán)35次(GAPDH 30次)。將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳,并使用凝膠成像掃描系統(tǒng)分析,灰度值即代表目的基因CD133的相對含量,取與其對應(yīng)的內(nèi)參照GAPDH灰度值之比進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測表面分子CD133的表達(dá)率

取貼壁生長至70%～80%融合、狀態(tài)良好的細(xì)胞分3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,其中一組加入0.500μmol/L的吉西他濱,另一組分別加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞來昔布,最后一組分別加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞來昔布同時(shí)聯(lián)合0.500μmol/L的吉西他濱,另設(shè)不加藥物的細(xì)胞作為對照(對照組)。培養(yǎng)48 h,胰酶消化,制成濃度為1×1010/L的單細(xì)胞懸液,加入鼠抗人CD133-PE (1∶20),或者同型對照抗體鼠抗人IgG-PE(1∶10),4℃孵育30 min,PBS洗脫未結(jié)合及非特異性結(jié)合抗體,30 min內(nèi)上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PPMS 1.5[4]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s,多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 吉西他濱與塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的影響

隨著吉西他濱藥物濃度增大,細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,差異有顯著性(F＝1 058.75,q＝9.03～76.41,P＜0.05);隨著塞來昔布濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,差異有顯著性(F＝527.42,q＝9.23～58.06,P＜0.05)。不同濃度塞來昔布與吉西他濱(0.500μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用對SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯,與0.500μmol/L吉西他濱組比較,差異均有顯著意義(F＝339.28～967.22,q＝4.48～36.76,P＜0.05),與對應(yīng)劑量的塞來昔布組比較,差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q＝16.24～66.23, P＜0.05)。見表1。

表1 各組SW1990細(xì)胞株增殖抑制率比較(±s)

注:?0.050μmol/L的吉西他濱＋不同濃度塞來昔布。

____分組_____藥物濃度(c/μmol·L－1)細(xì)胞增殖抑制率(χ/%)吉西他濱組 0.005 15.76±1.90 0.050 24.50±2.38 0.500 48.64±1.11 5.000 73.78±1.76 50.000 89.69±3.13塞來昔布組 6.25 8.48±0.29 12.50 18.48±0.96 25.00 31.47±1.79 50.00 47.86±3.27 100.00 71.38±3.80兩者聯(lián)合組?6.25 53.12±4.15 12.50 59.38±2.25 25.00 67.46±0.95 50.00 80.86±1.32 _______________________________________________________________ 100.00 89.38±1.66

2.2 吉西他濱與塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW-1990 CD133m RNA表達(dá)的影響

對照組胰腺癌細(xì)胞株SW1990 CD133mRNA表達(dá)為1.02±0.06,加入0.500μmol/L吉西他濱組為1.167±0.015,兩組比較差異有顯著性(t＝－3.97, P＜0.05)。12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞來昔布組胰腺癌細(xì)胞株SW1990 CD133m RNA表達(dá)分別為0.76±0.02、0.58±0.09、0.39±0.01、0.15± 0,04,較對照組表達(dá)明顯下調(diào)(F＝51.84～625.80, q＝14.39～45.03,P＜0.05);且隨濃度升高下調(diào)作用愈明顯,差異有顯著意義(F＝130.16,q＝7.86～26.62,P＜0.05)。分別加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞來昔布聯(lián)合0.500μmol/L吉西他濱組胰腺癌細(xì)胞株SW1990 CD133m RNA表達(dá)分別為0.90±0.03、0.66±0.01、0.48±0.02、0.22± 0.02,其下調(diào)作用較各濃度單藥塞來昔布減弱,差異有顯著性(q＝2.85～7.75,P＜0.05)。固定濃度塞來昔布(50.00μmol/L)分別作用于SW1990細(xì)胞0、24、36、72 h后,SW1990 CD133m RNA表達(dá)分別為1.02±0.06、0.89±0.05、0.74±0.06、0.42±0.04,各時(shí)間點(diǎn)相比較,差異有顯著意義(F＝118.16,q＝5.47～25.24,P＜0.05)。

2.3 吉西他濱與塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990表面分子CD133表達(dá)的影響

對照組、單藥吉西他濱組、不同濃度單藥塞來昔布組及不同濃度塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組在藥物作用48 h后,對照組SW1990表面分子CD133表達(dá)率為(15.33±0.91)%,加入0.500μmol/L吉西他濱組為(18.34±1.25)%,較對照組表達(dá)明顯升高,差異有顯著性(t＝－3.38,P＜0.05)。加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞來昔布組SW1990表面分子CD133表達(dá)率依次為(9.51±0.61)%、(8.46±0.20)%、(6.36±0.12)%、(4.47±0.15)%,較對照組表達(dá)明顯下調(diào)(F＝111.52～639.60,q＝19.79～45.01,P＜0.05),且隨濃度升高下調(diào)作用愈明顯,差異有顯著性(F＝223.94,q＝7.01～33.64, P＜0.05)。加入12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L塞來昔布聯(lián)合0.500μmol/L吉西他濱組SW1990表面分子CD133表達(dá)率依次為(10.51±0.32)%、(9.09±0.18)%、(7.39±0.20)%、(5.08±0.15)%,其下調(diào)作用較各濃度單藥塞來昔布減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(q＝2.57～4.24,P＜0.05)。

3 討 論

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差的消化系統(tǒng)腫瘤,發(fā)病率逐年升高,對放化療不敏感,病死率高,數(shù)十年來胰腺癌相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究一直為學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)[1,5-6]。近年來,CSC理論日益受到重視,CSC為具有自我更新和分化潛能的腫瘤細(xì)胞,與非CSC細(xì)胞相比,CSC對放、化療不敏感[7],具有較強(qiáng)的致瘤能力,為胰腺癌放化療抵抗及復(fù)發(fā)的重要原因。LEE等[8]應(yīng)用流式細(xì)胞分選技術(shù)從胰腺癌組織中分選出表型為CD＋44CD＋24ESA＋的細(xì)胞亞群,雖然該細(xì)胞亞群只占癌細(xì)胞總數(shù)的0.2%～0.8%,卻具有極高的致瘤性。LI等[9]通過異種移植模型培養(yǎng)人胰腺癌原代細(xì)胞,成功分離出以CD＋44CD＋24ESA＋為標(biāo)記的人胰腺癌CSC,證實(shí)該亞群的細(xì)胞具有多向分化和高致瘤的特征。最初人們在腦瘤和結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)了具有CD133表型的CSC,后來HERMANN等[10]在胰腺癌組織及細(xì)胞株中也分選出了同樣具有極強(qiáng)的致瘤性的CD＋133亞群細(xì)胞,該CD＋133細(xì)胞在受到吉西他濱作用后數(shù)量激增。LEE等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,移植人胰腺癌的免疫缺陷小鼠,其移植瘤經(jīng)放射線照射和吉西他濱作用后,表達(dá)CD＋44CD＋24ESA＋癌細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

近年來大量的研究結(jié)果顯示,非甾體類抗炎藥(NSADs)具有預(yù)防和抑制人類腫瘤特別是消化道腫瘤的作用,其作用主要與COX-2的活性有關(guān)[11]。塞來昔布可高選擇性抑制COX-2的活性,由于其靶向性強(qiáng)、副作用小,已在多種實(shí)體腫瘤包括胰腺癌的預(yù)防和治療中發(fā)揮作用[3]。有研究顯示,COX-2在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織[11],提示以COX-2為靶標(biāo),有可能成為治療和預(yù)防胰腺癌的新途徑。研究顯示,塞來昔布可增強(qiáng)胰腺癌放療敏感性[12]及對吉西他濱的化療敏感性[11],其機(jī)制涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成及腫瘤侵襲等多個(gè)方面[13-14]。

本研究將吉西他濱和塞來昔布聯(lián)合作用于胰腺癌細(xì)胞株SW1990,結(jié)果顯示,單用吉西他濱或塞來昔布對細(xì)胞的增殖抑制作用均呈明顯的量效關(guān)系,當(dāng)塞來昔布(50.00μmol/L)與吉西他濱(0.500μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用時(shí),對SW1990細(xì)胞的抑制率明顯提高,表明塞來昔布對吉西他濱抑制SW1990細(xì)胞的增殖有協(xié)同作用。PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,塞來昔布可下調(diào)CD133m RNA的表達(dá),且隨濃度增加其下調(diào)作用愈明顯,而單藥吉西他濱作用于細(xì)胞株,其CD133m RNA的表達(dá)較對照組高,與HREMANN等[10]的研究結(jié)果一致。當(dāng)塞來昔布與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí),SW1990表面分子CD133的表達(dá)率亦降低,但其下調(diào)趨勢無單藥塞來昔布明顯,表明吉西他濱對塞來昔布下調(diào)SW1990表面分子CD133的表達(dá)無協(xié)同作用。單藥塞來昔布作用于細(xì)胞時(shí),隨時(shí)間的延長, CD133m RNA的表達(dá)率也呈明顯下降趨勢。流式細(xì)胞術(shù)檢測從CD133表面分子水平上顯示了與PCR相似的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示,CD133標(biāo)記的CSC與COX-2抑制劑之間存在著某種關(guān)聯(lián),即COX-2抑制劑可能通過某種通路來降低CD133基因的表達(dá),既然CD133是CSC的標(biāo)記物,那么也就是說COX-2抑制劑可能通過某種途徑抑制CSC的增殖。將CD133分子標(biāo)記CSC從實(shí)體瘤分離,那么靶向CD133分子本身就可能成為治療CSC的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,塞來昔布可下調(diào)SW1990表面分子CD133的表達(dá),且此下調(diào)作用呈時(shí)間和劑量依賴性。最近的一項(xiàng)研究顯示,CD133陰性的細(xì)胞存在G1期阻滯[15],很多研究也顯示,塞來昔布能引起細(xì)胞周期阻滯[11,16-17],因此有可能塞來昔布引起CD133下調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,CD133陽性的細(xì)胞變成CD133陰性的細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞分化。隨著對CD133分子作用機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入,胰腺癌CSC將成為胰腺癌治療的新的靶點(diǎn),為胰腺癌的治療帶來新的希望。

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(本文編輯 厲建強(qiáng))

THE INFLUENCE OF CELECOXIB ON PROLIFERATION OF PANCREATIC CANCER CELL LINE SW1990 AND EXPRESSION OF STEM CELL MARKER CD133

LIU Li,FU Yalei,SHEN Fangzhen,SONG Jinxia,YAO Ruyong (Department of Onco-logy,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo observe the effect of cyclooxygenase-2(COX-2)selective inhibitor celecoxib on pancreatic cancer cell line SW1990 proliferation and stem cell marker CD133expression.MethodsThe SW1990 cells in logarithmic growth phase were cultured with different concentrations of gemcitabine,celecoxib and celecoxib combined with gemcitabine,respectively.The suppression of SW1990 proliferation,and m RNA of CD133were observed.ResultsIn combined celecoxib with gemcitabine group,the proliferation of SW1990 cells was more obvious as compared with gemcitabine group(0.500μmol/L),the difference between the two groups were significant(F＝339.28－967.22;q＝4.48－36.76;P＜0.05),the difference was also significant as compared with celecoxib group of corresponding dose(q＝16.24－66.23,P＜0.05).The expression of SW1990 CD133m RNA in celecoxib group was lower than that in the control(F＝51.84－625.80;q＝14.39－45.03;P＜0.05),in combined group,its down-regulated action was weaker than that in different-dose celecoxib groups,the differences being statistically significant(q＝2.85－7.75,P＜0.05).ConclusionCelecoxib inhibits the proliferation of SW1990,and has a joint action with gemcitabine.Celecoxib can dramatically down-regulate the expression of stem cell surface marker CD133m RNA.

pancreatic neoplasms;tumor stem cells;celecoxib;gemcitabine;CD133

R735.9

A

1008-0341(2013)04-0317-04

10.11712/qlyx201304012

2012-12-27;

2013-04-27

劉麗(1986-),女,碩士研究生。

沈方臻(1962-),女,碩士,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師。