黃倩,高玉芳,魏麗麗,陸連芳,張宏巖,馬曉燕

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院,山東青島 266021; 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

大鼠壓瘡缺血再灌注模型構(gòu)建及相關(guān)指標(biāo)觀察

黃倩1,高玉芳2,魏麗麗2,陸連芳2,張宏巖2,馬曉燕1

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院,山東青島 266021; 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的構(gòu)建大鼠不同分期的壓瘡缺血再灌注動(dòng)物模型,并分析其缺血再灌注損傷相關(guān)指標(biāo)的含量變化。方法將64只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、控制對(duì)照組、Ⅰ期壓瘡組、Ⅱ期壓瘡組、Ⅲ期壓瘡組、Ⅳ期壓瘡組、可疑深部組織損傷組、難以分期壓瘡組,每組8只。采用臀肌下埋置鐵片外加磁鐵加壓的方法構(gòu)建大鼠壓瘡缺血再灌注模型,檢測(cè)并比較各組超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、局部滲出液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結(jié)果大鼠各期壓瘡缺血再灌注動(dòng)物模型均構(gòu)建成功。與正常對(duì)照組比較,各期壓瘡組SOD活性明顯下降,MDA、CRP含量明顯增加,差異有顯著性(F＝55.54～156.90,q＝5.026～38.744, P＜0.05);各期壓瘡組之間比較,差異亦有顯著性(q＝4.086～33.642,P＜0.05)。局部滲出液中TNF-α含量Ⅲ期壓瘡組低于Ⅳ期壓瘡組,差異有顯著性(t＝5.82,P＜0.05)。結(jié)論構(gòu)建6期壓瘡動(dòng)物模型并明確各期壓瘡的生理變化,可為壓瘡相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療提供理論依據(jù)。

壓力性潰瘍;缺血;再灌注損傷;大鼠,Sprague-Dawley

壓瘡一直是長(zhǎng)期臥床病人難以解決的一大皮膚難題。在壓瘡治療方面,臨床觀察研究居多,基礎(chǔ)研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)外關(guān)于早期壓瘡動(dòng)物模型制備和形成機(jī)制的研究較多,但大多是根據(jù)1989年4期壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)或更早的壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)而構(gòu)建出的Ⅰ期、Ⅱ期早期壓瘡動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2007年美國(guó)國(guó)家壓瘡指導(dǎo)專(zhuān)家組(NPUAP)新公布的6期壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)[1],在WASSERMANN等[2]造模方法的基礎(chǔ)上,制備6期壓瘡動(dòng)物模型,并檢測(cè)各期壓瘡再灌注損傷相關(guān)指標(biāo)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠64只,月齡12～14周,體質(zhì)量(220±20)g,由我院附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水,室內(nèi)溫度維持在22～30℃,相對(duì)濕度50%～70%,明暗周期12 h。

1.1.2 試劑與材料 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)及腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELASA檢測(cè)試劑盒,均由南京建成生物工程研究所提供。圓形鐵片(直徑為12 mm,厚度1 mm,質(zhì)量1 g)和圓形磁鐵(直徑為12 mm,厚度2.5 mm,質(zhì)量2 g),均購(gòu)自青島青磁材料有限責(zé)任公司。磁鐵的磁通量密度為為0.16 T[3]。鐵片在植入皮膚前均經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理。

1.1.3 主要儀器 可見(jiàn)光分光光度計(jì),37℃恒溫氣浴箱,臺(tái)式離心機(jī),可調(diào)到95℃左右的恒溫水浴箱,標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,精密移液器,一次性吸頭,試管等。

1.2 動(dòng)物分組和模型建立

將64只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、控制對(duì)照組、Ⅰ期壓瘡組、Ⅱ期壓瘡組、Ⅲ期壓瘡組、Ⅳ期壓瘡組、可疑深部組織損傷組、難以分期壓瘡組,每組8只。大鼠適應(yīng)性生活2周后,正常對(duì)照組不做任何處理,繼續(xù)給予飼料正常喂養(yǎng)。余下的7組大鼠禁食12 h,自由飲水,用100 g/L水合氯醛(350 mg/ kg)腹腔注射麻醉后,臀部剪毛、備皮4 cm×5 cm大小,再用聚維酮碘消毒液對(duì)備皮區(qū)進(jìn)行消毒;在大鼠臀部做一深至肌肉層的切口,長(zhǎng)約2 cm,鈍性分離肌肉組織;將鐵片植入大鼠臀部肌肉下,縫合肌肉組織和筋膜,然后連續(xù)縫合皮膚層,再用碘附消毒以防止感染?？刂茖?duì)照組大鼠只給予鐵片植入;剩余的6組大鼠術(shù)后24 h在植入鐵片的皮膚外放置磁鐵,從而對(duì)皮膚及肌肉組織產(chǎn)生壓力,造成局部組織缺血,每次缺血2 h后將外源磁鐵取下30 min,讓局部血流恢復(fù),此操作為1個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1 血清CRP和TNF-α檢測(cè) 采用斷尾取血法采集大鼠尾靜脈血1 m L(取血前禁食12 h),收集創(chuàng)面局部滲出液,室溫放置1 h后將標(biāo)本置－20℃冰箱凍存待測(cè)。待全部標(biāo)本收集完畢后,3 000 r/ min離心15 min分離血清,分別應(yīng)用大鼠CRP和TNF-α的ELASA試劑盒檢測(cè)CRP含量和TNF-α含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 血清SOD活性和MDA含量測(cè)定 將各組大鼠麻醉后采集腹主動(dòng)脈血5 m L,放入不含抗凝劑的試管中,以3 600 r/min,4℃離心10 min,取血清。用分光光度計(jì)根據(jù)SOD和MDA試劑盒操作步驟檢測(cè)血清中SOD活性和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肉眼觀察

本文64只大鼠全部進(jìn)入結(jié)果分析,數(shù)據(jù)無(wú)缺失。根據(jù)2007年NPUAP公布的6期壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)[1],1個(gè)循環(huán)后大鼠皮膚雖完整但出現(xiàn)了壓之不褪色的紅斑,Ⅰ期壓瘡組造模成功;5個(gè)循環(huán)后大鼠受壓處皮膚出現(xiàn)粉紅色的破損,Ⅱ期壓瘡組造模成功;25個(gè)循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外,可見(jiàn)皮下組織,Ⅲ期壓瘡組造模成功;35個(gè)循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,損傷深達(dá)肌肉組織,露出鐵片,Ⅳ期壓瘡組造模成功;15或20個(gè)循環(huán)后大鼠受壓處皮膚呈紫色,出現(xiàn)瘀傷但局部皮膚完整,在膚色較深部位的組織損傷可能難以發(fā)現(xiàn),可疑深部組織損傷組造模成功;30個(gè)循環(huán)后大鼠受壓處全層傷口,失去全層皮膚組織,潰瘍被腐痂或痂皮覆蓋,只有腐痂或痂皮充分去除,才能確定真正的分期,難以分期壓瘡組造模成功。

2.2 各組大鼠CRP和TNF-α含量比較

各期壓瘡組與正常對(duì)照組比較、各期壓瘡組之間比較,血清CRP含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝132.61,q＝5.688～38.992,P＜0.01);控制對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,CRP含量差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。Ⅳ期壓瘡組局部滲出液中TNF-α含量明顯高于Ⅲ期壓瘡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.82,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較

各期壓瘡組SOD活性、MDA含量比較,差異有顯著性(F＝55.54、156.90,q＝3.330～38.744, P＜0.05);控制對(duì)照組與正常對(duì)照組SOD活性和MDA含量比較,差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 各期壓瘡組各指標(biāo)相關(guān)性

將6期壓瘡組(共48只)CRP、SOD、MDA值進(jìn)行相關(guān)性分析,SOD與CRP、MDA呈顯著負(fù)相關(guān)(r＝－0.940、－0.938,P＜0.01),CRP與MDA呈顯著正相關(guān)(r＝0.970,P＜0.01)。Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡局部滲出液中TNF-α與血清CRP、MDA呈正相關(guān)(r＝0.680、0.671,P＜0.05),與SOD呈負(fù)相關(guān)(r＝－0.678,P＜0.05)。

3 討 論

3.1 壓瘡缺血再灌注損傷模型構(gòu)建

壓瘡是由多因素共同作用形成的,其發(fā)生機(jī)制也存在著多種不同的假說(shuō),其中缺血再灌注損傷學(xué)說(shuō)是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[4]。本實(shí)驗(yàn)借鑒了WASSERMANN等[2]的裸鼠4期壓瘡模型的實(shí)驗(yàn)方法,通過(guò)改變?nèi)毖俟嘧⒌难h(huán)數(shù)成功構(gòu)建了大鼠6期壓瘡缺血再灌注模型,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,即缺血再灌注損傷時(shí)間的增加,其皮膚損傷程度逐漸加重。該方法最突出的優(yōu)勢(shì)是整個(gè)受壓和解壓過(guò)程中實(shí)驗(yàn)大鼠均處于非麻醉狀態(tài),可以排除麻醉因素對(duì)一些生化指標(biāo)的影響;但另一方面,該模型需提前植入鐵片,額外增加了皮膚和肌肉組織的損傷,有可能影響后期實(shí)驗(yàn)觀察。本實(shí)驗(yàn)中所有用到的鐵片在移植前均經(jīng)高壓滅菌,嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作原則,將其對(duì)結(jié)果的影響降到最小。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,本研究設(shè)了控制對(duì)照組(只植入鐵片,未給予缺血再灌注循環(huán)操作),結(jié)果顯示控制對(duì)照組與正常對(duì)照組之間各指標(biāo)結(jié)果差異無(wú)顯著性,說(shuō)明采用該方法造模不會(huì)影響結(jié)果。

表1 各組各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較(n＝8,±s)

_____組__別__________________CRP(ρ/μg·L－1)_______TNF-α(ρ/ng·L－1)SOD(z/k U·L－1)MDA(c/μmol·L－1)正常對(duì)照組228.99±4.63－187.19±4.97 7.61±0.55控制對(duì)照組230.88±4.48－184.11±6.83 8.01±0.46Ⅰ期壓瘡組260.80±13.22－173.77±7.78 8.80±0.57Ⅱ期壓瘡組284.84±12.69－155.75±7.07 13.68±0.72Ⅲ期壓瘡組363.74±16.46 21.42±1.02 134.57±7.34 27.97±0.87Ⅳ期壓瘡組448.94±22.50 24.83±1.31 115.56±6.69 36.31±1.11可疑深部組織損傷組327.34±20.65－144.84±11.35 21.83±2.00 ___難以分期壓瘡組_____________403.12±20.51______________________________________________________________________________________ ____________－125.68±6.85 31.66±5.27

3.2 壓瘡缺血再灌注損傷模型各指標(biāo)變化及意義

3.2.1 CRP、TNF-α含量變化及意義 近年來(lái),再灌注損傷與炎癥之間的關(guān)系備受關(guān)注,但關(guān)于炎癥與皮膚缺血再灌注損傷關(guān)系的研究較少。CRP和TNF-α都是反映體內(nèi)炎癥水平的重要指標(biāo),但尚未有研究證實(shí)CRP和TNF-α與各期壓瘡發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,壓瘡嚴(yán)重程度越來(lái)越重,各期壓瘡組CRP含量也逐漸增加,差異有顯著性;在造模過(guò)程中只有Ⅲ期和Ⅳ期壓瘡組出現(xiàn)了滲液,Ⅳ期壓瘡組TNF-α高于Ⅲ期壓瘡組,差異有顯著性。說(shuō)明炎癥反應(yīng)并非僅僅發(fā)生在壓瘡早期,它是貫穿在整個(gè)壓瘡發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的。伴隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,體內(nèi)炎性反應(yīng)逐漸加重,皮膚損傷程度也逐漸增加。本文相關(guān)分析結(jié)果顯示,Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡局部滲出液中TNF-α與血清CRP之間存在著正相關(guān),說(shuō)明在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)后,兩種炎性因子可能會(huì)互相激活,從而增強(qiáng)炎性損傷。因此,炎性因子的作用是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一。這與張純瑜等[5]的結(jié)論相一致。提示在今后的各期壓瘡治療過(guò)程中,抗炎治療均應(yīng)作為不可忽視的措施之一。

3.2.2 SOD活性和MDA含量變化及意義 有作者對(duì)不同壓迫緩解時(shí)間下SOD活性和MDA含量的變化及意義進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,若在短時(shí)間內(nèi)局部重復(fù)受壓,則可能加大壓瘡發(fā)生的危險(xiǎn)性[6-7]。本文結(jié)果顯示,隨著缺血再灌注循環(huán)數(shù)的增加,各期壓瘡組SOD活性逐漸降低,MDA含量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且SOD和MDA之間存在著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明當(dāng)皮膚發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí),體內(nèi)的自由基生成增多可引發(fā)組織氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致MDA含量增加;自由基還可使SOD失去活性,失活的SOD不能有效地清除自由基,MDA含量也因而進(jìn)一步升高,這樣就形成了一個(gè)惡性循環(huán)。這與郭樹(shù)忠等[8]的結(jié)論相一致。在壓瘡形成過(guò)程中,氧自由基起著重要的作用,SOD、MDA聯(lián)合檢測(cè)可有效判斷壓瘡的嚴(yán)重程度。

本研究在相同的實(shí)驗(yàn)操作人員、實(shí)驗(yàn)條件下,采用相同的實(shí)驗(yàn)方法,根據(jù)同一壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建出的6期壓瘡動(dòng)物模型更具客觀性,可為各期壓瘡研究提供基礎(chǔ)。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

CREATION OF PRESSURE ULCER ISCHEMIC-REPERFUSSION MODEL IN RATS AND OBSERVATION OF RELATED INDICA-TORS

HUANG Qian,GAO Yufang,WEI Lili,LU Lianfang,ZHANG Hongyan,MA Xiaoyan (Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo create models of different-stage pressure ulcer ischemic-reperfusion(PUIR)in rats and analyze its related indicators.MethodsSixty-four Sprague Dawley rats were equally randomized to eight groups as follows:normal group,control group,stage-Ⅰ-,stage-Ⅱ-,stage-Ⅲ-,stage-Ⅳ-PU group,suspected-deep-tissue-injury group and hard-to-staging-PU group.A rat model of PUIR was created by implanting an iron plate in gluteus and pressed with magnetic iron from outside.The content of superoxide dicmutase(SOD),malondialdehyde(MDA),C-reactive protein(CRP)and tumor necrosis factor-α (TNF-α)in the local exudate in each group were detected.ResultsEach-stage rat PUIR models were successfully created.Compared with the normal group,the activity of SOD in each group of different-stage PUIR was declined,while the content of MDA and CRP elevated,the differences being significant(F＝55.54－156.90,q＝5.026－38.744,P＜0.05);as compared between each PUIR group,the differences of that showed significance as well(q＝4.086－33.642,P＜0.05).The content of TNF-αin local exudate in stage-Ⅲ-PU group was lower than that in the stage-Ⅳ-PU group(t＝5.82,P＜0.05).ConclusionConstructing sixstage PU animal models and identifying physiological changes in different stages of PU can provide theoretical basis for PU-related experimental research and clinical therapy.

pressure ulcer;ischemia;reperfusion injury;rats,Sprague-Dawley

R471

A

1008-0341(2013)04-0365-04

10.11712/qlyx201304028

2013-03-01;

2013-06-14

青島市科技局計(jì)劃課題(2010KZJ-37)

黃倩(1987-),女,在讀碩士研究生。

高玉芳(1959-),女,主任護(hù)師,博士生導(dǎo)師。