鄭 遂，康 歡，趙 蕊，楊麗杰，霍貴成*

（1.乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

雙乙酰是乳制品中的重要風(fēng)味化合物[1-2]。和許多風(fēng)味物質(zhì)一樣，其可經(jīng)化學(xué)方法生產(chǎn)，但更好方法是在乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）中天然產(chǎn)生[3]。產(chǎn)雙乙酰支路的反應(yīng)物依次為：檸檬酸和（或）葡萄糖、丙酮酸、α-乙酰乳酸（αacetolactate，α-AL）、雙乙酰（及與其競爭的乙偶姻），相應(yīng)的酶分別為檸檬酸滲透酶（Citric permease，CIT）、α-AL合成酶（α-AL synthetase，ALS）和 乳 酸 脫 氫 酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、 AL脫 羧 酶（Acetolactate decarboxylase，ALD）和雙乙酰還原酶（Diacetyl reductase，DR），其酶活與菌數(shù)是雙乙酰高產(chǎn)與否的內(nèi)因。此外，pH、溫度、O2等為外因[4]。

已有很多以高產(chǎn)雙乙酰為目的LAB相關(guān)研究，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）方向研究很多[5]。但對糞腸球菌（Enterococcus faecalis）研究很少。其在干酪的檸檬酸代謝與脂解中起作用進而影響其風(fēng)味，在一些干酪（如Greek Feta、Mediterranean、Mozzarella、Cebreiro干酪）中含量豐富，并可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，已有將其開發(fā)為保健酸奶發(fā)酵劑的研究[6]。

本文以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室從內(nèi)蒙古農(nóng)家酸馬奶中篩選的野生糞腸球菌及其NTG誘變株為出發(fā)菌株，探索兩者生產(chǎn)雙乙酰的機理，比較分析pH、生長情況等重要因素對產(chǎn)雙乙酰的影響，確定最優(yōu)產(chǎn)雙乙酰條件及其最大產(chǎn)量，以期為開發(fā)產(chǎn)香型腸球菌發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

研究菌種為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室保存的Enterococcus faecalis KLDS 4.1004，分離自內(nèi)蒙古農(nóng)家酸馬奶，以及經(jīng)NTG誘變篩選獲得的誘變株KLDS 4.1003。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

雙乙酰、乙偶姻標樣為色譜純（Sigma公司），其他試劑均為分析純。MRS、平板計數(shù)培養(yǎng)基等均按照凌代文等的方法配制[7]。

1.1.3 儀器

DELTA 320 pH計，PL2002分析天平，Allegra 64R臺式高速冷凍離心機，BCN1360型生物潔凈工作臺，SPX-150B生化培養(yǎng)箱，HIRAYAMA HVE-50高壓滅菌器，ZHWY-100B搖床振蕩培養(yǎng)箱，DU-800紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及計數(shù)

將出發(fā)菌株以2%比例接種到11%脫脂乳中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝固，反復(fù)2～3次完成菌種的活化。菌體培養(yǎng)、生長速度測定及計數(shù)均為常規(guī)方法。

1.2.2 代謝相關(guān)酶活力的測定

1.2.2.1 無細胞提取液的制備

將1.5 mL出發(fā)菌過夜培養(yǎng)物加入150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)物對應(yīng)4瓶培養(yǎng)基。在37℃下，搖床培養(yǎng)48 h（180·rev-1）后，以5 000×g離心5 min收獲細胞，隨后在10 mL緩沖液（pH 7.0的100 mmol·L-1磷酸鈉，含0.1 mg溶菌酶·mL-1）中擴增并于室溫下培養(yǎng)15 min。懸浮物經(jīng)超聲破碎2 min后以15 000×g離心15 min，其上清液用作酶活測定。

1.2.2.2 酶活測定

按照Stormer的方法測定ALD酶活力[8]，對其中部分步驟進行了修改。將1單位酶活定義為每分鐘將AL催化成1 μmol乙偶姻所需要的量，制備10 mmol·L-1α-AL底物液和顯色反應(yīng)液，將0.2 mL前者加入0.2 mL無細胞提取液或0.1 mol·L-1磷酸鈉溶液（pH 7.0，含0.1 mg·mL-1溶菌酶）（作為空白對照）中，30℃水浴20 min。加入4.5 mL顯色反應(yīng)液來終止反應(yīng)，檢測OD522值。

按照Cogan的方法測定LDH、DR酶活力[9]，對其中部分步驟進行修改。將1單位酶定義為每分鐘1 μmol消耗或生成的NADH，應(yīng)用分光光度法測定酶活，將0.1 mL無細胞提取液與2.9 mL反應(yīng)混合液于培養(yǎng)皿中作用，并檢測隨后10 min的OD340值。LDH酶活檢測反應(yīng)液為100 mmol·L-1磷酸鈉（pH 7.0）、10 mmol·L-1丙酮酸鈉和0.15 mmol·L-1NADH，DR的為100 mmol·L-1磷酸鈉（pH 7.0）、10 mmol·L-1雙乙酰和0.15 mmol·L-1NADH。

用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，標準物為牛血清白蛋白。

1.2.3代謝物含量測定

雙乙酰和乙偶姻含量均采用經(jīng)典蒸餾比色法進行測定[10]。使用色譜純級標樣，標準曲線線性佳。

所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3～6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對雙乙酰產(chǎn)量的影響

2.1.1 pH對酶活的影響

綜合考慮以往LAB研究及市售乳制品pH，選擇4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共 8個點，對野生株KLDS 4.1004和誘變株KLDS 4.1003進行對比酶活分析，目標酶為與產(chǎn)雙乙酰/乙偶姻相關(guān)的LDH、ALD和DR，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，pH 8.0以外的7個點，不利于雙乙酰高產(chǎn)的3個酶之活力均為誘變株＜野生株（誘變株中ALD滅活，故圖中未顯示；pH 7.5時雖然極不明顯，但確有差別），3個酶起作用的順序及機理如圖2所示，故可以推測誘變株的產(chǎn)雙乙酰能力強于野生株。從野生株單獨看，DR活力從4.5～7.0一直下降，ALD活力以6.0和7.0為轉(zhuǎn)折點，先升后降再升，LDH趨勢更多變；pH 7.0時ALD、DR活力最低，僅為0.040 U·mg-1，但LDH活力不如7.5、8.0時低；而pH 7.5時LDH活力最低，僅為0.041 U·mg-1，但ALD和DR均為倒數(shù)第二低，故有必要在以下結(jié)果中比較兩者的產(chǎn)雙乙酰情況。從誘變株單獨看，其ALD失活，這非常有利于雙乙酰高產(chǎn)，DR活力從4.5到7.0有穩(wěn)有降，LDH活力從4.5到7.0趨勢為先大幅提升，而后保持平穩(wěn)，大幅下降直到7.0時最低；pH 7.0時DR、LDH活力均最低，僅為0.031和0.020 U·mg-1，故推測此pH點的雙乙酰產(chǎn)量最高；而pH 6.5時兩酶活力均為次低。

圖1 pH對KLDS 4.1004與4.1003相關(guān)酶活的影響Fig.1 Effect of pH on the enzymatic activities of KLDS 4.1004 and KLDS 4.1003

圖2 產(chǎn)雙乙酰代謝通路及相關(guān)酶Fig.2 Schematic representation of the diacetyl production metabolism and related enzymes

2.1.2 pH對菌體生長及代謝產(chǎn)物的影響

菌體產(chǎn)雙乙酰能力還要考慮菌體生長情況，故對兩菌在8個pH點進行最大生長速度和最大細胞計數(shù)進行對比測定，同時檢測出各pH點的最大雙乙酰產(chǎn)量及相應(yīng)的乙偶姻量，結(jié)果見圖3與表1。

圖3 不同pH時KLDS 4.1004與4.1003的最大生長速度Fig.3 μmax of KLDS 4.1004 and KLDS 4.1003 under different pH values

由圖表可見，6.5時兩菌的最大生長速度和最大細胞計數(shù)均最大，分別為1.22、1.45 h-1和3.1×109、3.5×109cfu·mL-1，其次為 pH 6.0、7.0、7.5時，最低為pH 4.5時。比較兩菌的最大生長速度，可發(fā)現(xiàn)4.5、5.0、6.0等3個點為野生株＞誘變株，但相差不明顯；另外4個點為誘變菌＞野生菌，且pH 6.5時差距較大。兩者的計數(shù)情況與生長速度基本相符。

表1 pH對KLDS 4.1004與4.1003菌數(shù)及代謝產(chǎn)物的影響Table 1 Effect of pH on cell count and metabolites of KLDS 4.1004 and 4.1003

誘變株的雙乙酰產(chǎn)量在所有點均遠大于野生株的，在6.5、7.0、7.5時尤其明顯，另外4.5、5.0、6.0時野生株中檢測不到雙乙酰，而誘變株則可檢測到，且4.5時的最低雙乙酰產(chǎn)量0.49 g·L-1，也約為野生株最高產(chǎn)量0.17 g·L-1（pH 7.0時）的3倍。5.0和5.5時的誘變株雙乙酰產(chǎn)量差異，在于菌數(shù)不同和pH對3酶以外酶的作用。6.0時野生株不產(chǎn)雙乙酰而誘變株產(chǎn)，可看出ALD對雙乙酰生成的重要意義。綜合考慮，可見6.5、7.0是研究重點，7.0時是因為此時酶活合適、6.5時是因為菌數(shù)較多。

乙偶姻產(chǎn)量均為野生株＞誘變株，在6.0時最高，達到11.04 g·L-1，此時檢測不到雙乙酰，可見碳流全部流向乙偶姻，4.5、5.0時碳流也如此。此外，野生株的最低乙偶姻量（pH 4.5，6.63 g·L-1）比誘變株的最高量（pH 6.5時，為6.59 g·L-1）都高。乙偶姻、雙乙酰的總量及兩者比例，是菌生長和酶活綜合作用的結(jié)果，對發(fā)酵風(fēng)味有重要影響。雖然乙偶姻也有風(fēng)味效果，但約為雙乙酰的1/100，故要盡量多產(chǎn)雙乙酰而少產(chǎn)乙偶姻。

2.2 pH 6.5、7.0時誘變株的產(chǎn)雙乙酰情況

為進一步綜合研究糞腸球菌高產(chǎn)雙乙酰以期達到最優(yōu)值，選擇誘變株表現(xiàn)最好的pH 6.5、7.0，分別在4、8、12、16、20、24 h等6個時間點檢測菌數(shù)及雙乙酰產(chǎn)量變化（生長溫度為糞腸球菌最適溫度37℃）[11]，結(jié)果見圖4、5。

圖4 pH 6.5時KLDS 4.1003的菌數(shù)及雙乙酰產(chǎn)量變化曲線Fig.4 Counts and diacetyl production curve of KLDS 4.1003 under pH 6.5

圖5 pH 7.0時KLDS 4.1003的菌數(shù)及雙乙酰產(chǎn)量變化曲線Fig.5 Counts and diacetyl production curve of KLDS 4.1003 under pH 7.0

由圖4、5可見，菌數(shù)和雙乙酰的最高值在pH 6.5、7.0點均出現(xiàn)于16 h，分別為3.5×109mL-1、1.12 g·L-1和2.9×109mL-1、1.29 g·L-1，并且趨勢也基本相同。菌數(shù)區(qū)別在于，6.5時前4 h增長大于7.0時的，16～20 h的下降大于7.0時；雙乙酰產(chǎn)量區(qū)別在于，6.5時最后4 h的下降趨勢沒有7.0時明顯。從菌數(shù)與雙乙酰產(chǎn)量關(guān)系來看，前16 h時兩者保持對應(yīng)關(guān)系，即雙乙酰產(chǎn)量隨菌數(shù)增多而提高，而最后8 h菌數(shù)基本保持穩(wěn)定，但雙乙酰產(chǎn)量大幅下降，說明有限的底物空間與營養(yǎng)中，菌數(shù)過多導(dǎo)致平均產(chǎn)雙乙酰能力均很低。

3 討論與結(jié)論

高產(chǎn)雙乙酰的前提是丙酮酸的積累，高產(chǎn)雙乙酰最理想菌株為CIT和ALS活力很高，LDH、ALD、DR活力極低甚至滅活[12]，但尚未見報道具備以上所有條件的菌株，因為即使獲得該菌株，也會因酶變過多而導(dǎo)致生長緩慢、無法傳代、代謝紊亂等諸多問題。本試驗所用的誘變株KLDS 4.1003具有CIT活力高（資料未顯示）、LDH、DR活力低及ALD滅活等有利特點，其發(fā)酵產(chǎn)雙乙酰量可高達1.29 g·L-1。

雖然這與以往研究中的基因調(diào)控Lactococcus lactis的雙乙酰產(chǎn)量相比較低[13]，但除菌種本身特點（生長特性及酶活）外，還因為本研究未通過添加血紅素、檸檬酸、極限有氧呼吸等方式以及基因操作來加大產(chǎn)量。因此，本試驗最接近乳制品的自然發(fā)酵，且目標菌株是GRAS，因此對開發(fā)產(chǎn)香型益生發(fā)酵劑具有理論指導(dǎo)意義，同時豐富了LAB丙酮酸代謝理論。

在后續(xù)研究中，可針對乳制品（如干酪）發(fā)酵的具體條件，進一步考慮其他實際因素對風(fēng)味形成的影響；還可與桿菌共生來協(xié)同提高雙乙酰產(chǎn)量并研究檸檬酸-葡萄糖的共發(fā)酵。在后基因組時代，可應(yīng)用各級組學(xué)、GC-MS、NMR等高通量方法進行系統(tǒng)研究，從生物信息學(xué)、一般分子生物學(xué)方法和下游數(shù)據(jù)三個層面研究問題。

[1]Curioni P M G,Bosset J O.Key odorants in various cheese types as determined by gas chromatography-olfactometry[J].Int Dairy J,2002(12):959-984.

[2]Neves A R,Pool W A,Kok J,et al.Overview on sugar metabolism and its control inLactococcus lactis-The input fromin vivoNMR[J].FEMS Microbiol Rev,2005,29(8):531-554.

[3]Hugenholtz J.The lactic acid bacterium as a cell factory for food ingredient production[J].Int Dairy J,2008,18(5):466-475.

[4]Niel E W,Palmfeldt J,Martin R,et al.Reappraisal of the regulation of lactococcal L-lactate dehydrogenase[J].Appl Environ Microbiol,2004,70:1843-1846.

[5]Oliveira A P,Nielsen J,Forster J.Modeling Lactococcus lactis using a genome-scale flux model[J].BMC Microbiology,2005,39(5):39-44.

[6]Vaningelgem F,Ghijsels V,Tsakalidou E,et al.Cometabolism of citrate and glucose by Enterococcus faecium FAIR-E 198 in the absence of cellular growth[J].Appl Environ Microbiol,2006(1):319-326.

[7]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:85-86.

[8]Stormer F C.2,3-Butanediol biosynthetic system in Aerobacter aerogenes[J].Methods Enzymol,1975,41:526-529.

[9]Cogan TM(1981)Constitutive nature of the enzymes of citrate metabolism in Streptococcus lactis ssp.diacetylactis[J].J Dairy Res,1981,48:489-495.

[10]Boumerdassi H,Monnet C,Desmazeaud M,et al.Effect of citrate on production of diacetyl and acetoin by Lactococcus lactis ssp.lactis CNRZ 483 cultivated in the presence of oxygen[J].J Dairy Sci,1997,80:634-639.

[11]Repizo G D,Mortera P,Magni C.Disruption of the alsSD operon of Enterococcus faecalis impairs growth on pyruvate at low pH[J].Microbiol,2011,157:2708-2719.

[12]Gaspar P,Neves A R,Ramos A,et al.Engineering Lactococcus lactis for production of mannitol:High yields from food-grade strains deficient in lactate dehydrogenase and the mannitol transport system[J].Appl Environ Microbiol,2004,70:1466-1474.

[13]付良，劉飛，霍貴成.乳酸乳球菌抗氧化的研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(6):132-136.