李 杰，曹宇婷，徐 欣，張 旭，李 璐，呂 洋，盧松沖

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

20世紀(jì)80年代后半期，應(yīng)用DNA同源重組原理，基因置換技術(shù)逐漸發(fā)展并應(yīng)用到多種領(lǐng)域。利用基因置換技術(shù)，克服隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，能夠?qū)?xì)胞染色體進(jìn)行精確修飾和改造構(gòu)建目標(biāo)載體，而目經(jīng)修飾和改造的基因能進(jìn)行穩(wěn)定遺傳[1]。目前，基因置換技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、釀酒酵母、畢赤酵母、絲狀真菌和動(dòng)物等的基因敲除、轉(zhuǎn)基因和基因修飾研究中?？唆斁S酵母是天然新鮮牛乳中含有的微生物，來(lái)源于克魯維酵母菌的乳糖酶是一種中性乳糖酶，不僅活性高，其最適pH與天然牛乳的pH（6.6～6.8）最為接近[2]，適合工業(yè)化處理牛乳和乳清。此外，來(lái)源于克魯維酵母菌的乳糖酶另一優(yōu)點(diǎn)是在低溫時(shí)仍具有較好活力，可在低溫下分解乳糖，避免乳品加工過(guò)程中的腐敗菌污染引起牛奶酸敗變質(zhì)。但是，來(lái)源于克魯維酵母的乳糖酶產(chǎn)量并不理想，采用基因工程手段提高乳糖酶表達(dá)量是增加乳糖酶產(chǎn)量的有效方法。

本研究以中性乳糖酶生產(chǎn)菌脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis）為材料，通過(guò)構(gòu)建以脆壁克魯維酵母乳糖酶基因上游調(diào)控區(qū)為同源臂的基因置換載體，優(yōu)化脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的條件，試圖建立一套有效的脆壁克魯維酵母基因置換技術(shù)，以期為利用精確的基因修飾技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)中性乳糖酶生產(chǎn)菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

菌株脆壁克魯維酵母（哈爾濱美華生物技術(shù)有限公司提供），質(zhì)粒pPIC9K（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)雙寶講師惠贈(zèng)），質(zhì)粒pTPlac、pPkan（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究室構(gòu)建所得）。

1.1.2 試劑

Pyrobest Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶（購(gòu)自大連寶生物工程公司）；DNA膠回收試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（購(gòu)自大連寶生物工程公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD：用于酵母培養(yǎng)，主要成分有10 g·L-1酵母提取物，20 g·L-1蛋白煉，20 g·L-1葡萄糖。

YPDG：用于轉(zhuǎn)化子篩選，主要成分有10 g·L-1酵母提取物，20 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，200 mg·L-1G418。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pPkan的構(gòu)建和線(xiàn)性化

采用CTAB法提取脆壁克魯維酵母基因組，以其為模板，利用Plac擴(kuò)增引物（Sence-Plac：5'TC GCCGATTTGTAACACTCCT 3'，Antisence-Plac:5'CTCGTCAATGACCCAGAAGCC 3'，3.2 kb）擴(kuò)增乳糖酶基因調(diào)控區(qū)Plac，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，酶切正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送交測(cè)序。根據(jù)pPIC9K的序列（Invirtrogen公司）和PLac序列，對(duì)質(zhì)粒pPIC9K和pTPLac進(jìn)行Mfe I和Eco R V雙酶切，電泳回收載體片段和目的片段，加入T4DNA連接酶連接構(gòu)建質(zhì)粒pPkan。電擊轉(zhuǎn)化時(shí)，用Sal I和Eco R I線(xiàn)性化質(zhì)粒pPkan。

1.2.2 脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.2.2.1 脆壁克魯維酵母的活化培養(yǎng)及感受態(tài)的制備

挑取脆壁克魯維酵母的單菌落接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。再以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600=0.5～1.5，4℃。5 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，用100 mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體重懸。4℃，5 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用50 mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體重懸。4 ℃，5 000 r·min-1離心10 min，再用20 mL，1 mol·L-1山梨醇洗滌 1次，溶于200 μL 1 mol·L-1冰預(yù)冷的山梨醇中，以備轉(zhuǎn)化(現(xiàn)做現(xiàn)用)。

1.2.2.2 脆壁克魯維酵母生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率的影響

每隔1 h對(duì)二次活化的脆壁克魯維酵母培養(yǎng)液取樣測(cè)OD600值，繪制生長(zhǎng)動(dòng)力曲線(xiàn)，并取處于OD600為0.5、0.8、1.0、1.5的脆壁克魯維酵母制備感受態(tài)，以1.0 kV電壓進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后培養(yǎng)60 min涂板。

1.2.2.3 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化率的影響

固定電容 C=25 μF，電阻=200 Ω，OD600為0.8，以電壓分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 kV進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后培養(yǎng)60 min涂板。

1.2.2.4 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

OD600為0.8，電壓1.5 kV，電擊后分別培養(yǎng)0、30、60、90、120 min進(jìn)行涂板。

1.2.3 限制內(nèi)切酶介導(dǎo)法在酵母電擊轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

OD600為0.8，電壓1.5 kV，取200 μL感受態(tài)細(xì)胞加入質(zhì)粒pPkan混合均勻。分別加入0、5、8、10限制性?xún)?nèi)切酶Eco R I和Sau I，冰浴30 min后，以電壓1.5 kV進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)60 min，吸取200 μL涂布。

圖1 重組質(zhì)粒pPKan的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pPKan

1.2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

根據(jù)pPIC9K的序列和pTPLac序列分析，應(yīng)用軟件Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物對(duì)Genekan用以檢測(cè)kan基因的插入（Genekan-Sense:5'GATGG TCGGAAGAGGC 3'，Genekan-Antisense:5'CCAGT AGTAGGTTGAGGC 3'，600 bp），引物對(duì) Upkan、Downkan分別用以檢測(cè)上下游同源臂的同源插入（Upkan-Sense:5'TTTGCCCACCCTCTTG 3'，Upkan-Antisense:5'TTGCCCGCTAATGCTA 3'，1.5 kb;Downkan-Sense:5'CAAGTATGTCTGCCTGTATT 3'，Downkan-Antisense:5'AGCCTCCAAGTTCGTAT 3'，1.0 kb）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.1.1 脆壁克魯維酵母生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率影響

每隔一小時(shí)對(duì)二次活化的脆壁克魯維酵母培養(yǎng)液取樣測(cè)OD600值，得到生長(zhǎng)動(dòng)力曲線(xiàn)(見(jiàn)圖2)。

脆壁克魯維酵母的不同生長(zhǎng)期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出較大影響，當(dāng)OD600為0.8時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，為1.92×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，繼續(xù)培養(yǎng)反而使轉(zhuǎn)化率下降（見(jiàn)圖3），說(shuō)明處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中前期的細(xì)胞可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效果。

圖2 脆壁克魯維酵母生長(zhǎng)動(dòng)力曲線(xiàn)Fig.2 Curve of growth of Kluyveromyces fragilis

圖3 OD600 對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Ecffect of OD600 on electroporation Kluyveromyces fragilis

2.1.2 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化率的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度是電擊轉(zhuǎn)化中最敏感的參數(shù)，直接影響轉(zhuǎn)化率[3]，而電容C=25 μF，電阻=200 Ω比較適合微生物電擊轉(zhuǎn)化[4]，試驗(yàn)中采用0.2 cm的小電擊槽，固定其他參數(shù)，調(diào)節(jié)電壓從0.5～2.5 kV，得到電場(chǎng)強(qiáng)度為2.5～12.5 kV·cm-1。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為7.5 kV·cm-1時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到2.37×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，繼續(xù)增加電壓，轉(zhuǎn)化率反而下降（見(jiàn)圖4）。這種轉(zhuǎn)化頻率隨電壓的變化說(shuō)明了較低的電壓不足以引起細(xì)胞變化為易于接受外源DNA的生理狀態(tài)，而過(guò)高的電壓則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大的傷害，細(xì)胞膜產(chǎn)生不可逆破裂[3]，使細(xì)胞死亡率過(guò)高，有效轉(zhuǎn)化率降低。

圖4 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Eeffect of voltage on electroporation of Kluyveromyces fragilis

2.1.3 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

在相同的試驗(yàn)條件下，電擊后加入培養(yǎng)基立即涂布和培養(yǎng)不同時(shí)間后涂布。電擊后培養(yǎng)120 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。這種轉(zhuǎn)化頻率隨轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時(shí)間的變化說(shuō)明了由于標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入后，需要較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)其功能。電擊后培養(yǎng)120 min后涂板相較于培養(yǎng)90 min后涂板，轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有顯著的提高（見(jiàn)圖4），造成這種結(jié)果的原因可能由于培養(yǎng)90 min已經(jīng)足夠時(shí)間使電擊后的脆壁克魯維酵母進(jìn)行恢復(fù)，延長(zhǎng)時(shí)間僅促進(jìn)酵母的分裂繁殖，考慮到縮短操作時(shí)間和培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞分裂不利于轉(zhuǎn)化子篩選等因素[5]，以培養(yǎng)90 min后涂板為宜。

圖5 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Eeffect of culture time on electroporation of Kluyveromyces fragilis

2.2 限制內(nèi)切酶介導(dǎo)法在酵母電擊轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

限制酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是在限制酶存在下用線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化真菌，外源基因可以插在基因組的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，從而獲得轉(zhuǎn)化子。REMI被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原真菌以及其他真菌的轉(zhuǎn)化中[6-8]，普遍可獲得較高的轉(zhuǎn)化率[9-10]。該方法首先在酵母菌中由Schiestl建立，轉(zhuǎn)化率比直接轉(zhuǎn)化提高了7倍[11]。而在本試驗(yàn)中，加入限制內(nèi)切酶后，與未加入限制內(nèi)切酶的對(duì)照相比轉(zhuǎn)化率僅相差0.2×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，并未顯著提高轉(zhuǎn)化率，可能原因是Schiestl建立的REMI法建立在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ)上，而本試驗(yàn)中采取的電擊轉(zhuǎn)化法已經(jīng)具有較高的轉(zhuǎn)化率，因此REMI法并未對(duì)轉(zhuǎn)化率有顯著的提高。

2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6～8。

圖6 PCR擴(kuò)增檢測(cè)kan基因Fig.6 Detection of kan gene by PCR

圖7 PCR擴(kuò)增檢測(cè)上游同源臂的插入優(yōu)點(diǎn)Fig.7 Detection of insertion site of upstream homologous arm by PCR

圖8 PCR擴(kuò)增檢測(cè)下游同源臂的正確插入Fig.8 Detection of insertion site of downstream Homologous arm

電擊轉(zhuǎn)化法是目前轉(zhuǎn)化效率最高的轉(zhuǎn)化方法之一，但采用電擊轉(zhuǎn)化法時(shí)，發(fā)生假陽(yáng)性的頻率也是最高的[12]。因此，僅僅利用抗性或利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)重組子進(jìn)行篩選是不夠的，有必要對(duì)重組子進(jìn)行二次篩選，最簡(jiǎn)便有效的二次篩選法為PCR法。隨機(jī)選取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，用引物對(duì)kan基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，可擴(kuò)增出600 bp條帶的即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，試驗(yàn)結(jié)果證明80%的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（見(jiàn)圖6）。用引物對(duì)Upkan、Downkan對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的整合位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，上下游分別可擴(kuò)增出1.5 kb、1.0 kb條帶即為進(jìn)行了同源重組的轉(zhuǎn)化子，試驗(yàn)結(jié)果證明陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中87.5%進(jìn)行了同源重組（見(jiàn)圖7～8），獲得較高的同源重組率。

3 討論與結(jié)論

基因置換技術(shù)在研究基因功能和實(shí)現(xiàn)基因精確缺失有廣泛應(yīng)用，但成功率低[13]，提高同源重組率和轉(zhuǎn)化率是解決問(wèn)題關(guān)鍵。同源臂長(zhǎng)度對(duì)同源重組率有重要影響，在釀酒酵母系統(tǒng)中，當(dāng)兩端同源臂為30 bp時(shí)，同源重組率可高達(dá)80%[14]。而在非常規(guī)酵母系統(tǒng)中，如多形漢遜酵母，即使兩端同源臂為1 kb時(shí)，同源重組率僅為50%[15]。脆壁克魯維酵母為非常規(guī)酵母，試驗(yàn)選擇1 kb同源區(qū)作為同源臂，以期獲得較高的同源重組率。對(duì)脆壁克魯維酵母的電擊轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。不同的轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率有較大影響，研究可知，制備感受態(tài)時(shí)脆壁克魯維酵母的生長(zhǎng)時(shí)期和電擊轉(zhuǎn)化時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，合適條件可以提高轉(zhuǎn)化率，以O(shè)D600為0.8的脆壁克魯維酵母為受體、電場(chǎng)強(qiáng)度為7.5 kV·cm-1、電擊后培養(yǎng)時(shí)間為90 min，可獲得較高的轉(zhuǎn)化率，最高轉(zhuǎn)化效率為2.37×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。而采用REMI法，在電擊轉(zhuǎn)化的同時(shí)加入限制性?xún)?nèi)切酶，對(duì)電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著影響。

試驗(yàn)的下一步將以乳糖酶基因上游調(diào)控區(qū)缺失的脆壁克魯維酵母為載體，對(duì)其啟動(dòng)子的上游激活序列及信號(hào)肽進(jìn)行基因工程改造。對(duì)其啟動(dòng)子的上游激活序列的改造，在提高乳糖酶的生物活性的基礎(chǔ)上，并未有改變脆壁克魯維酵母乳糖酶本身的基因序列，避免以往表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因時(shí)，分泌表達(dá)的蛋白不能正確折疊和修飾加工等問(wèn)題引起乳糖酶的活性降低甚至失活；并嘗試已在畢赤酵母中成功表達(dá)了外源蛋白的信號(hào)肽α-Factor信號(hào)肽和菊粉酶基因信號(hào)肽INU，以期獲得高表達(dá)中性乳糖酶的分泌型表達(dá)載體。

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