王 倩 楊海鵬 鄒 敏 宋洪元

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.〕是我國(guó)特產(chǎn)蔬菜之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，在我國(guó)南、北方均有種植，是重要的加工類(lèi)蔬菜。在芥菜生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛存在著諸如病毒病、先期抽薹、加工品質(zhì)等問(wèn)題（楊景華 等，2006），植物雜種優(yōu)勢(shì)的利用可以在一定程度上解決這些問(wèn)題。由于芥菜類(lèi)作物自交親和指數(shù)非常高，雜種優(yōu)勢(shì)育種難以通過(guò)自交不親和途徑得以實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致長(zhǎng)期以來(lái)芥菜類(lèi)蔬菜品種選育都是以常規(guī)品種為主。雖然近年來(lái)利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育在芥菜優(yōu)勢(shì)育種上取得了一定的進(jìn)展，但如何發(fā)掘、創(chuàng)造優(yōu)良的芥菜雄性不育材料仍是當(dāng)前芥菜雄性不育研究的重要內(nèi)容之一。隨著基因工程雄性不育系成功在油菜、玉米、菊苣等農(nóng)作物上得到商業(yè)化應(yīng)用（Kempken，2010），圍繞花粉的發(fā)育過(guò)程，已通過(guò)多種途徑建立了植物工程雄性不育系。利用具有特異時(shí)空表達(dá)特性的花藥絨氈層特異啟動(dòng)子與解淀粉芽孢桿菌的Barnase核糖核酸酶基因融合，導(dǎo)入植物體內(nèi)調(diào)控花粉發(fā)育，從而獲得雄性不育材料成為其中應(yīng)用最為普遍的方法。該方法分別在花椰菜（Reynaerts et al.，1993）、煙草（李勝國(guó) 等，1995）、油菜（鐘蓉 等，1996）、甘藍(lán)（沈革志 等，2001）、番茄（白玲 等，2002）、菜薹（曹必好和孟成民，2008）等作物上成功獲得了雄性不育材料?；趯?duì)芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)制的研究，Yang 等（2010）將來(lái)自線粒體的編碼基因orf220導(dǎo)入莖用芥菜中獲得雄性不育材料。相對(duì)于其他農(nóng)作物，有關(guān)芥菜植物基因工程雄性不育的研究報(bào)道較少，為拓寬芥菜雄性不育資源，本試驗(yàn)將煙草絨氈層TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的Barnase基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入莖用芥菜，獲得了轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株，從分子水平、細(xì)胞學(xué)水平和結(jié)籽情況等方面調(diào)查分析了轉(zhuǎn)基因植株的育性，結(jié)果顯示Barnase基因在芥菜絨氈層特異表達(dá)后能導(dǎo)致徹底的雄性不育，但伴隨花朵變小，雌蕊、種莢變短，結(jié)籽數(shù)量下降的現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

含雄性不育基因的表達(dá)載體pCABarTA29-Bn的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存（圖1）。

圖1 pCABarTA29-Bn 植物表達(dá)載體

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2012年2月7日～7月15日在西南大學(xué)南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試芥菜品種為渝豐榨菜，由重慶科光種苗有限公司提供。

TaqDNA 聚合酶和DNA marker 購(gòu)自全式金生物工程有限公司；羧芐青霉素（Carbenicilin）、卡那霉素（Kanamycine）、鏈霉素（Streptomycin）、吲哚乙酸（IAA）、6 芐基腺嘌呤（6-BA）以及細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；植物DNA 提取、植物組織培養(yǎng)以及顯微制片的各種化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。除草劑Basta（草丁膦，主要成分為PPT）購(gòu)自日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株氏會(huì)社。

1.3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法（王關(guān)林和方宏筠，2002；曹必好 等，2003）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并略有改動(dòng)：取苗齡7 d 的渝豐榨菜幼苗的下胚軸，切成1 cm 長(zhǎng)的莖段，在分化培養(yǎng)基（MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上預(yù)培養(yǎng)2 d，用濃度OD600=0.5～0.6的農(nóng)桿菌菌液侵染10 min，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d，隨后在篩選培養(yǎng)基（MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上進(jìn)行多次篩選，每14 d 換1次培養(yǎng)基，最后將再生植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（MS+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的分子檢測(cè)

采用改進(jìn)的CTAB 法提取芥菜總DNA（宋洪元 等，2010）。以提取的總DNA 為模板，用TA29啟動(dòng)子上游引物（TA29-1：5′-CGCGGTACCCCAAGATTGCATAAG-3′）和Barnase基因下游引物（BN-2：5′-CCCCTCGGATCCGTTATCTGATCTTTGTA-3′）進(jìn)行TA29啟動(dòng)子及下游Barnase基因的PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：模板DNA 1μL（30 ng·μL-1），上下游引物各1μL （10 ng·μL-1），dNTP Mixture 0.2μL （2.5 mmol·L-1），MgCl22.0 μL（25 mmol·L-1），TaqDNA 聚合酶0.3 μL（5 U·μL-1），10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至總體積為25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花器官的觀察和授粉試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)基 因以及野生型芥菜植株當(dāng)天開(kāi)放的花，觀察比較雄蕊和花藥的形態(tài)結(jié) 構(gòu)。分別調(diào)查雄性不育轉(zhuǎn)基因芥菜植株自交以及用野生型芥菜植株的花粉進(jìn)行人工授粉后的結(jié)籽情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因芥菜植株雄性不育花藥、花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察

取芥菜轉(zhuǎn)基因雄性不育株和野生型可育株的不同大小花蕾，投入FAA 固定液固定至少24 h，之后按照常規(guī)石蠟法制作切片（鄒瑞昌 等，2012）：各級(jí)酒精脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→展片→脫蠟→染色，最后在LEICACTR5000 顯微鏡下鏡檢并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得

芥菜幼苗下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌菌液浸染后，在含除草劑有效成分8 mg·L-1PPT 的培養(yǎng)基上進(jìn)行多輪篩選，篩選過(guò)程中非轉(zhuǎn)化個(gè)體逐漸黃化死亡，抗性個(gè)體成苗并正常生根，生根后移栽到土壤中，獲得5株成活轉(zhuǎn)基因芥菜植株（圖2）。

提取成活植株DNA，利用引物TA29-1 和BN-2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在5株轉(zhuǎn)基因植株中均獲得了約630 bp 的DNA片段（圖3），表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因組中。

圖2 轉(zhuǎn)化過(guò)程中芥菜植株生根和移栽成苗

2.2 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花器官形態(tài)

盡管獲得的轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株形態(tài)間無(wú)明顯差異，但開(kāi)花時(shí)轉(zhuǎn)基因植株花朵偏小，并伴隨花瓣較小、雌蕊短且粗、雄蕊短縮的現(xiàn)象；而野生型植株則表現(xiàn)為花瓣大、雌蕊細(xì)長(zhǎng)、雄蕊粗壯（圖4）。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株花藥瘦小、干癟、無(wú)花粉囊及花粉；野生型植株則花藥飽滿，花粉囊充滿大量花粉（圖5）。

圖3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖5 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花藥的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花藥發(fā)育過(guò)程

在TA29啟動(dòng)子的作用下，Barnase基因在花藥絨氈層組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生水解絨氈層組織細(xì)胞內(nèi)的RNA 的核糖核酸水解酶，阻礙花藥絨氈層的發(fā)育，從而導(dǎo)致雄性不育的產(chǎn)生。顯微切片結(jié)果顯示（圖6），花藥發(fā)育早期，轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株均在花藥的4個(gè)角隅處形成正常的藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層和造孢細(xì)胞，呈蝴蝶形排列（圖6-1，6-4）。野生型植株進(jìn)入減數(shù)分裂期，花粉母細(xì)胞變?yōu)闄E圓形，絨氈層細(xì)胞體積增大；進(jìn)入單核初期，剛釋放出來(lái)的游離小孢子形狀不規(guī)則，細(xì)胞壁很??；單核晚期，細(xì)胞壁逐漸加厚且趨于圓球形，絨氈層開(kāi)始降解（圖6-2）；單核小孢子發(fā)生有絲分裂后，進(jìn)入二核期，絨氈層只余殘跡，生殖核再次有絲分裂形成兩個(gè)精核，花粉粒趨于成熟，絨氈層最后在花藥即將開(kāi)裂釋放花粉粒時(shí)已完全消失（圖6-3）。而轉(zhuǎn)基因植株的花藥中，當(dāng)花粉母細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)，藥室內(nèi)壁的絨氈層細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始降解，并伴隨花粉母細(xì)胞的退化（圖6-5）；減數(shù)分裂后絨氈層細(xì)胞和花粉母細(xì)胞進(jìn)一步退化解體，無(wú)小孢子母細(xì)胞釋放，藥室呈現(xiàn)空洞狀（圖6-6）。

圖6 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花藥發(fā)育過(guò)程

2.4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的結(jié)實(shí)性

轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株開(kāi)花后，自交花朵的果莢基本不能膨大，部分脫落，無(wú)種子形成（圖7-A1），而野生型植株則結(jié)籽正常（圖7-B）。轉(zhuǎn)基因植株用野生型植株的花粉授粉后，基本均能結(jié)實(shí)（圖7-A2），但與野生型植株（圖7-C2）相比果莢較短，不飽滿，且種子數(shù)少（圖7-C1）。該結(jié)果顯示煙草TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase基因在芥菜植株的花藥絨氈層表達(dá)后，除了影響絨氈層細(xì)胞的發(fā)育從而獲得雄性不育外，對(duì)雌蕊以及其他花器官的發(fā)育也有一定的影響。

圖7 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的結(jié)籽情況

3 結(jié)論與討論

TA29是從煙草中克隆的一個(gè)絨氈層特異表達(dá)基因，在煙草減數(shù)分裂期到小孢子有絲分裂期的絨氈層中特異表達(dá)，在其他器官和花的其他組織中均沒(méi)有表達(dá) （Koltunow et al.，1990）。該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase基因在絨氈層中表達(dá)后獲得了煙草和油菜雄性不育材料（Mariani et al.，1990）。隨后基于TA29-Barnase雄性不育的轉(zhuǎn)基因油菜獲得商業(yè)化應(yīng)用。然而，后來(lái)有研究顯示TA29-Barnase基因?qū)е碌男坌圆挥龑?duì)溫度敏感，在溫度升高后轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不同程度的育性恢復(fù)現(xiàn)象。如在轉(zhuǎn)基因煙草和油菜的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度低于20℃時(shí)不育性穩(wěn)定，溫度升高到25℃時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)育，30℃時(shí)大部分可育（鐘蓉 等，1996）。另外，TA29-Barnase基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)后發(fā)現(xiàn)雄性不育植株的園藝學(xué)性狀與未轉(zhuǎn)化植株相同，不育植株的花朵表現(xiàn)為雄蕊完全退化，但蜜腺和雌蕊健全，能接受外來(lái)花粉，雜交結(jié)實(shí)率較高，但是轉(zhuǎn)基因植株中存在全不育植株和半不育植株，半不育植株在開(kāi)花中后期出現(xiàn)育性恢復(fù)現(xiàn)象（沈革志 等，2001）。該基因在 菜薹中表達(dá)后產(chǎn)生的雄性不育植株在30～35℃/25～28℃的高溫條件下自交全部不能結(jié)籽，沒(méi)有育性恢復(fù)現(xiàn)象發(fā)生（曹必好和孟成民，2008）。本試驗(yàn)利用該基因獲得的芥菜雄性不育植株的生長(zhǎng)發(fā)育全程處于控溫條件下的人工氣候室內(nèi)，其雄性不育性是否受田間溫度變化的影響有待進(jìn)一步研究。通過(guò)原位雜交和啟動(dòng)子報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因分析顯示，TA29基因?qū)Ｒ恍缘卦诮q氈層細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)時(shí)期為減數(shù)分裂期到花粉壁增厚期（-1 到+6 期）（Koltunow et al.，1990）。但在棉花中的研究結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子除了在棉花花藥中優(yōu)勢(shì)表達(dá)外，其控制的基因也會(huì)在棉花的葉片表皮毛和花粉中表達(dá)（尹夢(mèng)回 等，2008）。同時(shí)，TA29-Barnase轉(zhuǎn)基因棉花除花藥干癟、花粉無(wú)活力外，也表現(xiàn)出花朵變小、花絲變短等現(xiàn)象（Zhang et al.，2007），這與本試驗(yàn)所獲得的芥菜雄性不育轉(zhuǎn)基因植株的花器官類(lèi)似。但本試驗(yàn)獲得的雄性不育芥菜植株除了上述特點(diǎn)外，還出現(xiàn)了雌蕊偏短、種莢變短的現(xiàn)象，說(shuō)明TA29-Barnase基因在芥菜中表達(dá)后，對(duì)非靶標(biāo)組織的影響相對(duì)其他已報(bào)道的植物更大。因此，在利用Barnase基因創(chuàng)建芥菜雄性不育系時(shí)，有必要尋找更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕q氈層啟動(dòng)子表達(dá)Barnase基因，減少對(duì)花器官中非靶標(biāo)細(xì)胞、組織發(fā)育的影響，獲得結(jié)籽能力正常的雄性不育系，從而實(shí)現(xiàn)一代雜種的經(jīng)濟(jì)有效地繁育。

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