牟香麗 王 超 王 帥

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

植物能夠適應外界環(huán)境的變化并能生存下來的一個重要機制是能夠分泌蠟質到角質層表面或者角質層內(nèi)，充當阻擋紫外輻射及病蟲侵害的第一道屏障（Kunst & Samuels，2003）。蠟質存在于植物的木栓層、受傷的組織（Hamiton，1995）、花粉、種皮等組織器官中（Preuss et al.，1993）。近年來，與植物表皮蠟質相關的研究越來越多，已經(jīng)從小麥（Muria & Taira，1999）、擬南芥（Broun et al.，2004）、水稻（周小云，2006）、小鹽芥（趙寶，2007）等植物中克隆了一些與蠟質相關的基因，這為闡明蠟質組分的生理生化作用及其分子機制打下了基礎。

結球甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）是世界上許多國家的主要蔬菜作物，其表面都披有不同程度的蠟粉霜，葉色呈粉藍色或藍綠色；而無蠟粉的亮葉型結球甘藍突變體整個株體表面無蠟粉覆蓋，顏色油亮，葉脈呈黃綠色或綠色，整株光澤度和綠色度都要高于野生型。經(jīng)過多年的選培工作，該突變性狀已能穩(wěn)定遺傳，為了區(qū)別原來的普通甘藍，稱此類型甘藍為亮葉甘藍。據(jù)初蓮香和王余文（1993）報道，亮葉甘藍質地脆嫩，葉片薄，有光澤，富含糖、VC 及干物質等營養(yǎng)成分。亮葉甘藍還具有一定的抗蟲性，Stoner（1990）研究認為，在無蠟粉甘藍上，甘藍蚜的種群數(shù)量比正常甘藍植株低1/10，小菜蛾幼蟲的數(shù)量是正常植株的1/10；Lin等（1984）發(fā)現(xiàn)無蠟粉甘藍能影響初孵小菜蛾的產(chǎn)卵、取食等行為，而且1 齡幼蟲在無蠟粉甘藍上的成活率不到正常植株的10%。因此，對于甘藍無蠟粉突變體的研究具有十分重要的意義。

關于植物葉表蠟粉突變體的報道甚多，蠟質基因一直被研究者所關注，但對蠟質突變體超顯微水平的研究甚少，實際上對蠟質突變體超微結構進行觀察對于了解蠟質突變情況及探索蠟質發(fā)育意義重大。本試驗以突變型亮葉甘藍和野生型結球甘藍為試材，對甘藍葉片發(fā)育過程中表皮最外層蠟質發(fā)育及突變情況進行系統(tǒng)地觀察，以期在超顯微水平上了解甘藍無蠟粉突變體。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蠟質缺失突變型甘藍材料亮葉98-1030 和蠟質正常的野生型甘藍材料98-1030，均由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院甘藍課題組提供和保存。98-1030 為早熟甘藍品種迎春自交得到，早熟，圓球形，蠟粉正常；2007年，在以98-1030 為試驗材料進行組織培養(yǎng)試驗時，發(fā)現(xiàn)無蠟粉突變體，顏色油亮，無蠟粉，并命名為亮葉98-1030。

試驗于2012年春在本院園藝站和農(nóng)場進行。將98-1030 和亮葉98-1030 播種于園藝站溫室，并于四葉一心時移栽于農(nóng)場大田。

1.2 方法

自甘藍幼苗出土開始，在一葉苗期、三葉苗期、結球前期、結球后期及成熟期分別取樣。在苗期選取新生幼葉為材料，在結球期和成熟期選取最內(nèi)層外葉為材料。

掃描電鏡樣品制作：分別將新鮮葉片沖洗干凈，避開葉脈切成5 mm×10 mm 的長方形小塊，寫好編號，四氧化鋨熏蒸48 h，晾干3 d，E-1010（HITACHI）型離子濺射鍍膜儀鍍金膜，置于S-3400N（Hitachi）型掃描電子顯微鏡下進行觀察。

2 結果與分析

2.1 一葉苗期甘藍葉表皮蠟質超微結構

甘藍種子出苗后，第1片真葉剛剛展開時，從外觀上看，甘藍蠟質突變型與野生型的子葉光滑度和綠色度沒有明顯區(qū)別；第1片真葉在綠色度和光滑度上也差別不顯著。

分別將突變型和野生型的甘藍幼苗子葉和真葉置于掃描電子顯微鏡下。結果表明（圖1）：兩者的子葉表皮蠟質差異極顯著，突變型葉片表皮有類似瘤狀突起，處于蠟質發(fā)育的初始階段，未形成獨立的蠟質顆粒；而野生型葉片表皮蠟質數(shù)量明顯多于突變型，蠟質晶體結構為片狀或聚集成團。兩者的第1片真葉表皮蠟質差異顯著，突變型葉片表皮還未見蠟質發(fā)育；而野生型已有逐漸發(fā)育完全的蠟質晶體，發(fā)育進程由顆粒狀到片狀再到不規(guī)則三維結構。

2.2 三葉苗期甘藍葉表皮蠟質超微結構

三葉苗期的甘藍葉片已經(jīng)完全暴露到外界環(huán)境中，表觀上突變型與野生型甘藍幼苗葉片綠色度和光滑度已有差異，突變型葉片光滑且亮綠；野生型葉片覆有蠟粉霜。

電鏡觀察結果表明（圖2），突變型葉片表皮的背腹面都發(fā)現(xiàn)有蠟質晶體存在，但是發(fā)育不健全，以顆粒狀為主，即使片狀也比野生型的蠟質晶體?。灰吧拖炠|晶體發(fā)育成熟，以片狀、針狀為主。

2.3 結球前期甘藍葉表皮蠟質超微結構

結球前期的甘藍根、莖、葉都處于快速生長時期。表觀上突變型與野生型葉片綠色度和光滑度差異極為顯著，突變體葉片光滑，顏色亮綠；野生型葉片粉藍色，覆有蠟粉霜。

電鏡觀察結果（圖3），突變型與野生型葉片背腹面蠟質晶體積累都進一步增加。突變型的蠟質晶體仍然是顆粒狀，且其數(shù)量腹面比背面多；野生型的蠟質晶體排列更加密集，腹背面出現(xiàn)不同的晶體結構，腹面主要是圓柱狀，背面主要是片狀。

圖1 一葉苗期甘藍葉表皮蠟質晶體掃描電鏡觀察結果（×3000，×2000）

圖2 三葉苗期甘藍葉表皮蠟質晶體掃描電鏡觀察結果（×3000）

2.4 結球后期甘藍葉表皮蠟質超微結構

結球后期的甘藍根、莖、葉處于生長旺盛時期，各器官已經(jīng)趨于成熟。表觀上突變型甘藍的外葉和球葉呈現(xiàn)亮綠色；而野生型甘藍的外葉呈粉藍色，球葉呈粉綠色，都覆有蠟粉霜。電鏡觀察此期突變型葉片腹面蠟質晶體為顆粒狀，背面蠟質晶體不明顯；野生型葉片背腹面蠟質晶體密集，以片狀為主（圖4）。

圖3 結球前期甘藍葉表皮蠟質晶體掃描電鏡觀察結果（×3000）

圖4 結球后期甘藍葉表皮蠟質晶體掃描電鏡觀察結果（×3000）

2.5 成熟期甘藍葉表皮蠟質超微結構

甘藍成熟期，葉球的外葉數(shù)、質量、體積和開展度基本上停止變化，外葉的功能進一步退化?？v切突變型與野生型甘藍葉球，由外到內(nèi)顏色均由綠色到黃綠再到淺黃過度，其心葉顏色無明顯區(qū)別。但外葉顏色差別顯著，突變型的外葉顏色亮綠，野生型外葉粉藍色且覆有蠟粉霜。電鏡觀察突變型葉表蠟質晶體仍然是以顆粒狀為主；野生型蠟質晶體由棒狀轉化成針狀或片狀，片狀晶體的末端分散，有蠟質晶體進一步崩潰的跡象（圖5）。

圖5 成熟期甘藍葉表皮蠟質晶體掃描電鏡觀察結果（×3000）

3 結論與討論

植物葉片表皮最外層蠟質晶體結構一直是研究的熱點，Koch 和Ensikat（2008）認為植物葉片表皮蠟質晶體為不規(guī)則的三維結構，垂直分布在葉片表面；Barthlott 等（1998）將植物表皮蠟質的微觀形態(tài)結構分為柱狀、棒條狀、垂直片狀、線狀、煙囪狀等26 類，其中片狀和管狀是蠟質晶體結構中最主要的類型。本試驗中，野生型甘藍葉片表皮蠟質晶體垂直分布在葉片表面，且不同生長時期表現(xiàn)出不同的蠟質晶體結構，苗期以顆粒狀、片狀和針狀為主，結球期以圓柱狀和片狀為主，成熟期以片狀和針狀為主，片狀晶體結構是甘藍整個生長期的最主要類型。電鏡觀察蠟質發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，當蠟質晶體積累逐漸增多時，晶體鑲嵌排列更加緊密，電鏡下觀察不易發(fā)現(xiàn)氣孔結構?？梢酝茰y，蠟質晶體密布成網(wǎng)覆蓋在葉片表面，作為葉表天然的保護層，使甘藍在生長中期和后期有更強的抗逆性。本試驗觀察到甘藍葉表皮腹面蠟質數(shù)量要多于背面，這可能與葉片腹—背軸非對稱發(fā)育有關，此觀察結果也與周小云（2006）、曾愛松等（2009）的研究結果相似。

另外，本試驗通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變型甘藍材料蠟質缺失極顯著，與李景濤等（2012）的研究結果一致。但本試驗發(fā)現(xiàn)突變型甘藍苗期子葉和真葉有顆粒狀和發(fā)育不完全的片狀蠟質晶體，而且整個生長期以顆粒狀晶體結構為主?？梢酝茰y，即使表觀無蠟粉的甘藍突變體實際上也有蠟質晶體發(fā)育萌芽，可能是某種原因阻礙了蠟質晶體的進一步發(fā)育，究其是阻斷了蠟質合成途徑還是阻礙了蠟質運輸途徑，或是其他原因，還需要進一步探索。

關于甘藍葉片表皮蠟質突變體已多有報道，但研究還不夠深入。今后，如果能從分子水平去研究突變基因的功能，成功克隆一些相關基因，再通過基因工程手段改良角質層性狀，從而提高甘藍的抗旱及抗病能力，這在育種上意義會更大。

初蓮香，王余文.1993.無蠟粉亮葉結球甘藍的發(fā)現(xiàn)及其利用.遼寧農(nóng)業(yè)科學，（3）：49-50.

李景濤，楊麗梅，方智遠，劉玉梅，莊木，張揚勇，孫培田.2012.結球甘藍10Q-961 無蠟粉亮綠性狀遺傳規(guī)律初探.中國蔬菜，（12）：37-41.

曾愛松，劉玉梅，方智遠.2009.甘藍耐裂球性與葉表面微形態(tài)及細胞組織結構的關系研究.華北農(nóng)學報，（2）：41-45.

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