汪 波， 劉艷艷， 李家斌,2△

(1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科， 安徽 合肥 230022； 2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院感染科， 安徽 巢湖 238000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是引起肝硬化、肝衰竭以及肝細(xì)胞肝癌的主要病因[1],當(dāng)前主要治療藥物包括核苷酸類似物(nucleotide analogues,NAs)和聚二乙醇化干擾素α(peginterferon α,Peg-IFNα)兩大類。Peg-IFNα較NAs除了具有抗病毒作用外還具有免疫調(diào)節(jié)的功能，有限療程(48周)Peg-IFNα治療可以使25%～30%的患者獲得持久的治療應(yīng)答[2]；但是Peg-IFNα在臨床應(yīng)用過程中存在治療費(fèi)用高、副作用大以及應(yīng)答率相對較低等問題，因此選擇合適的患者接受Peg-IFNα治療仍是有待解決的重要臨床問題。乙肝e抗原(HBeAg)水平是評估疾病狀態(tài)及抗病毒療效的一項(xiàng)重要血清學(xué)指標(biāo)，HBeAg血清轉(zhuǎn)換多預(yù)示疾病的緩解[3]，但是HBeAg血清轉(zhuǎn)換的機(jī)制仍不完全清楚。由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏保真性，病毒在長期感染復(fù)制過程中容易發(fā)生突變；其中前核心(precore, PC)區(qū)G1896A和基本核心啟動(dòng)子(basal core promoter, BCP)區(qū)A1762T/G1764A突變可以終止或降低HBeAg合成，因此與HBeAg血清轉(zhuǎn)換存在一定關(guān)系[4]。

近年來有研究提出，CHB患者治療前HBV存在PC區(qū)G1896A和/或BCP區(qū)A1762T/G1764A位點(diǎn)變異均可能會(huì)降低Peg-IFNα療效，從而不推薦將Peg-IFNα作為此類患者首選治療方案[5-6]；但是此類研究對象以西方A/D基因型CHB患者占主體，無法代表國內(nèi)B/C基因型為主的CHB患者治療情況。國內(nèi)相關(guān)研究則局限于病例數(shù)少、治療使用普通干擾素以及療程不足48周[7-8],因而PC/BCP區(qū)相關(guān)突變對國內(nèi)B/C基因型為主的CHB患者48周足療程Peg-IFNα-2b治療應(yīng)答的影響尚不明確。此外患者體內(nèi)HBV PC/BCP區(qū)突變情況在治療前后的變化鮮有報(bào)道，是否與干擾素療效存在關(guān)系仍不清楚。因此，本研究的目的是通過分析HBeAg陽性CHB患者中PC/BCP區(qū)突變情況，探討其與Peg-IFNα-2b病毒學(xué)和血清學(xué)應(yīng)答的關(guān)系，以及PC/BCP區(qū)突變在Peg-IFNα-2b治療前后的變化情況，為臨床工作者的診療選擇提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

所有HBeAg陽性CHB患者均來自于先前的一項(xiàng)安徽省隨機(jī)開放多中心Ⅳ期臨床研究[9-10](2012年6月～2014年7月),共有100名患者參與初始臨床試驗(yàn)，排除11位血清標(biāo)本不全患者，共89例患者血清進(jìn)行測序分析；去除20例測序失敗(重復(fù)2次)患者，最終69例患者納入當(dāng)前研究。每位患者診斷及治療指征符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》[11]：(1)HBsAg和HBeAg兩項(xiàng)均陽性并且超過6個(gè)月;(2)HBV DNA≥20 000 IU/mL且丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)≥2×正常值上限(upper limit of normal value,ULN)，≤10×ULN;(3)血清總膽紅素<2×ULN。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并HAV、HCV、HDV、HEV或HIV等其它病毒感染;(2)有精神病史及未控制的癲癇、失代償肝硬化等;(3)任何其它嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的。所有患者均簽署知情同意書，研究得到安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(Grant No: K2010003)。

2 研究方法

2.1治療方法及隨訪 入選本研究的69例患者均接受Peg-IFNα-2b(商品名佩樂能，愛爾蘭先靈葆雅公司)1.5 μg/kg，每周1次，皮下注射；其中35例(51%)患者隨機(jī)聯(lián)合阿德福韋酯(10 mg/d，口服)；療程共48周并隨訪24周。每位患者于第0、4、8、12、24、36、48、60和72周定期隨訪并采集外周靜脈血20 mL，離心取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2臨床實(shí)驗(yàn)室檢查 患者HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平由患者隨訪時(shí)于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科實(shí)驗(yàn)室檢測完成。Roche COBAS TaqMan 48熒光定量PCR儀檢測HBV DNA載量，檢查下限為20 IU/mL，檢測上限為1.70×108IU/mL。HBsAg、HBeAg和HBeAb檢測使用美國羅氏公司產(chǎn)品：HBsAg檢查下限為0.05 IU/mL；HBeAg<1 COI為陰性，>1 COI為陽性；HBeAb<1 COI為陽性，>1 COI為陰性。HBV基因型在患者治療前由上海之江生物有限公司檢測完成。

2.3HBV病毒基因組提取、擴(kuò)增及測序 取患者第0周和第72周于-80 ℃保存的血清各200 μL，按照QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen)說明，提取基因組DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)中國HBV參考序列[12]，使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)一對引物：上游引物F1為5’-GCAATGTCAACGACCGACCT-3’，下游引物R1為5’-CACCCCAACACAGAATAGCTTG-3’，擴(kuò)增片段(第1 677～2 069位核苷酸)包含PC區(qū)和BCP區(qū)。擴(kuò)增條件為:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s、57.3 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物直接送華大基因測序，測序結(jié)果使用Chromas 2.1和Lasergene 7.1軟件分析。

2.4分組及治療應(yīng)答 分組參考Sonneveld等[5]的研究，分為野生型(wild-type,WT;無G1896A和A1762T/G1764A突變)和突變型(存在G1896A和/或A1762T/G1764A突變)，其中突變型包括PC突變型(只存在G1896A突變，或同時(shí)存在G1896A突變和野生株)、BCP突變型(只存在A1762T/G1764A突變，或同時(shí)存在A1762T/G1764A突變和野生株)和PC+BCP突變型(同時(shí)存在G1896A、A1762T/G1764A突變，有或無野生株)。根據(jù)患者HBeAg基線水平四分位數(shù)可分為4組：第1組(基線HBeAg<1.958 0 logIU/mL)，第2組(>1.958 0，<2.891 9 logIU/mL)，第3組(>2.891 9，<3.028 9 logIU/mL)和第4組(>3.028 9 logIU/mL)。HBeAg血清轉(zhuǎn)換定義為：HBeAg<1 COI(陰性)，HBeAb<1 COI(陽性)。聯(lián)合應(yīng)答(combined response，CR)：72周隨訪結(jié)束時(shí)HBeAg血清轉(zhuǎn)換+HBV DNA<2 000 IU/mL。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。R×C列聯(lián)表資料的2檢驗(yàn)若P<0.05，則進(jìn)行任意兩組間比較(卡方分割)并行顯著性校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 患者特征

由于患者接受Peg-IFNα-2b單藥(n=34，49%)與聯(lián)合阿德福韋酯(n=35，51%)對其72周治療應(yīng)答無影響(HBeAg血清轉(zhuǎn)換率兩組比較2=0.189，P=0.664；聯(lián)合應(yīng)答率兩組比較2=0.289，P=0.591)，再結(jié)合文獻(xiàn)[5-6, 13]的分組方式，2組患者將被合并分析基線特征及治療學(xué)應(yīng)答，見表1。

2 患者PC/BCP區(qū)基線突變情況

BCP區(qū)A1762T/G1764A野生型和突變型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果見圖1A、1B；PC區(qū)G1896A野生型和突變型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果見圖2C、2D。69例患者中14例檢測為WT(20.29%)，55例檢測為突變型(79.71%)，其中PC突變型19例(27.53%)，BCP突變型20例(28.99%)，PC+BCP突變型16例(23.19%)，見表1。根據(jù)HBV基因型再分類，B基因型患者中PC突變型占18例(51%)，而C基因型患者中僅1例(3%)；C基因型患者中BCP突變型占19例(58%)，而B基因型患者中僅1例(3%)。B/C基因型患者在WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構(gòu)成比上存在差異(2=34.553，P<0.001)，見圖2。

表1患者基線特征

Table 1. Baseline characteristics of the study cohort (Mean±SD.n=69)

IndexDataDemographics Age (year)26.7±5.6 Sex (male/female)47/22 (68.1%/31.9%)Peg-IFNα-2b monotherapy34 (49.3%)Laboratory results ALT (U/L)231.26±131.29 HBV DNA (logIU/mL)7.48±1.24 HBsAg (logIU/mL)4.04±0.61 HBeAg (COI)645.30±454.60HBV genotype B35 (50.7%) C33 (47.8%) Others1 (1.4%)Sequencing results WT14 (20.29%) PC mutant19 (27.53%) BCP mutant20 (28.99%) PC+BCP mutant16 (23.19%)

HBeAg: hepatitis B e antigen; HBsAg: hepatitis B surface antigen.

3 WT和突變型患者基線血清標(biāo)志物的比較

與突變型相比，WT患者HBeAg基線水平更高(t=2.312，P=0.024)，ALT水平較低(t=2.312，P=0.012)，而年齡、HBV DNA和HBsAg的差異則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

4 72周時(shí)患者PC/BCP區(qū)突變情況

72周時(shí)共59例(86%)患者標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物測序成功。治療后14例WT患者中10例(71%)轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃停恢委熀驪C突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型患者也均存在突變情況的改變，但均未發(fā)現(xiàn)向WT逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象；患者基線和72周WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構(gòu)成比發(fā)生明顯變化(2=13.178，P=0.004)，見圖3。

5 WT和突變型患者HBeAg基線水平及治療應(yīng)答比較

根據(jù)所有患者的HBeAg水平四分位數(shù)，由低到高將患者分為4組,隨著HBeAg滴度的增高，WT患者在各組所占百分比表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，見圖4A;第1組在72周有著相對更高的HBeAg轉(zhuǎn)陰率和聯(lián)合應(yīng)答率(53%和41%)，4組在72周時(shí)的HBeAg轉(zhuǎn)陰率和聯(lián)合應(yīng)答率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Fisher確切概率法,P=0.070和P=0.054,P值均接近臨界值)，見圖4B。

Figure 1. The sequencing results for BCP region A1762T/G1764A (A and B) and PC region G1896A sites (C and D).

圖1BCP區(qū)A1762T/G1764A和PC區(qū)G1896A位點(diǎn)測序結(jié)果

Figure 2. Frequencies of PC and BCP mutants at baseline in the study cohort with HBV genotypes B and C.

圖2B、C基因型患者WT和各突變型所占百分比

6 PC區(qū)和BCP區(qū)突變對治療72周患者應(yīng)答效果的影響

所有患者根據(jù)突變情況分為WT組和突變型組，72周時(shí)HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和聯(lián)合應(yīng)答率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Fisher確切概率法，P=0.523和P=1.000)，見圖5A。當(dāng)患者根據(jù)突變情況分為WT組、BCP突變型組、PC突變型組和PC+BCP突變型組時(shí)，72周時(shí)HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和聯(lián)合應(yīng)答率的差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Fisher確切概率法，P=0.207和P=0.590)，見圖5B。

討 論

乙肝病毒感染是世界性公共衛(wèi)生難題，全球約有2.4億慢性乙型肝炎患者，中國大約有9 300萬[14]。積極的抗病毒治療是阻止慢性乙型肝炎疾病進(jìn)展的重要手段，Peg-IFNα在其中發(fā)揮了重要作用[1]。

表2 WT和突變型患者基線水平血清標(biāo)志物的比較

*P<0.05vsWT group.

Figure 3 Baseline and week 72 sequencing results in patients (n=59).

圖3患者基線和72周WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型變化情況

Figure 4. The proportion of WT and mutant divided by baseline HbeAg level (A) and relationship between baseline HbeAg level and response to Peg-IFNα-2b at week 72 (B). Combined response was defined as HBeAg serconversation and HBV DNA<2 000 IU/mL at week 72.

圖4HBeAg基線水平與突變的關(guān)系及對應(yīng)答的影響

HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療過程中一項(xiàng)重要的血清學(xué)應(yīng)答指標(biāo)，而影響HBeAg血清轉(zhuǎn)換包括宿主、病毒及治療方案等多種因素[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換與HBV病毒PC區(qū)G1896A和BCP區(qū)A1762T/G1764A變異終止或降低HBeAg合成存在一定關(guān)系[4]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)治療前WT組較突變型組HBeAg水平明顯偏高，這與之前的研究是相符合的[13, 17]。但是對于PC和BCP區(qū)相關(guān)變異對Peg-IFNα治療應(yīng)答的影響依然存在爭議。Sonneveld等[5]的一項(xiàng)回顧性研究提示PC和/或BCP區(qū)突變型HBeAg陽性CHB患者很難獲得對Peg-IFNα的治療應(yīng)答，從而提出治療前WT患者可以作為Peg-IFNα的最適治療對象，而突變型患者則不建議接受Peg-IFNα治療。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，不管是72周HBeAg血清轉(zhuǎn)換率還是聯(lián)合應(yīng)答率，WT和突變型患者均未表現(xiàn)出顯著差異。這可能是因?yàn)槲覀兊难芯繉ο笠試鴥?nèi)B/C基因型患者為主，而Sonneveld等[5]的研究對象以歐洲A/D基因型患者為主；且A基因型CHB患者PC/BCP突變的發(fā)生率本身較低。因此人種和基因型的差異可能造成了CHB患者對Peg-IFNα不同治療應(yīng)答的結(jié)局，而PC/BCP區(qū)相關(guān)變異與Peg-IFNα應(yīng)答可能并不存在相關(guān)性。

Figure 5. Relationship between WT and mutant groups and response at week 72 in total cohort (A) and response between each group (B). Combined response was defined as HBeAg serconversation and HBV DNA<2 000 IU/mL at week 72.

圖5PC區(qū)和BCP區(qū)突變與72周患者應(yīng)答效果的關(guān)系

當(dāng)我們根據(jù)患者治療時(shí)HBeAg基線滴度由低到高分為4組分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)72周4組HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和聯(lián)合應(yīng)答率的差異均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但HBeAg低滴度組似乎有著更高的聯(lián)合應(yīng)答率，這仍然有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)，突變型患者較WT有著更高的ALT基線水平。這可能是因?yàn)镻C/BCP區(qū)突變可能導(dǎo)致Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)高表達(dá)[18]，而TLR2為炎癥介導(dǎo)因子，此時(shí)高ALT水平可能預(yù)示著患者體內(nèi)肝細(xì)胞炎癥應(yīng)答活躍，干擾素可能也更易發(fā)揮作用。這可能與本研究中突變型患者應(yīng)答略好于WT存在一定關(guān)系。這樣的發(fā)現(xiàn)仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

我們對72周測序成功的患者突變情況分析發(fā)現(xiàn)，患者基線和72周時(shí)WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構(gòu)成比發(fā)生明顯變化，存在向BCP突變型和PC+BCP突變型集中的趨勢，而突變型在72周時(shí)未發(fā)生向WT逆轉(zhuǎn)。這可能提示了HBV準(zhǔn)種在Peg-IFNα介導(dǎo)的機(jī)體免疫壓力下的自然選擇過程。Nie等[19]研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換過程中PC/BCP變異是累計(jì)增高的，這與Peg-IFNα介導(dǎo)的突變位點(diǎn)改變是相似的。HBV準(zhǔn)種的動(dòng)態(tài)變化為今后的抗病毒治療也提供了新的思路。

本研究依然存在一些缺陷，普通測序技術(shù)對樣本中低于20%以下的突變株較難檢測[20]，這可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。這有待更靈敏的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來驗(yàn)證我們的觀點(diǎn)。

綜上所述，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)HBV病PC區(qū)G1896A和BCP區(qū)A1762T/G1764A變異與B/C基因型為主的HBeAg陽性CHB患者Peg-IFNα-2b治療應(yīng)答并無明顯關(guān)系。若國內(nèi)根據(jù)PC/BCP變異與否判斷患者Peg-IFNα療效可能會(huì)產(chǎn)生偏差；對于患者治療前后HBV病毒PC/BCP變異構(gòu)成比發(fā)生改變這一現(xiàn)象，尚需進(jìn)一步的覆蓋宿主、病毒和治療方案的多方面分層研究，從而對CHB抗病毒治療做出更加詳細(xì)可靠的分析，以達(dá)到個(gè)體化治療的目的。