吳 軍， 夏瑗瑜， 陳 杰， 肖 玲， 王 優(yōu)， 趙媛媛， 葉 剛， 尹青橋△

(武漢第三醫(yī)院 1內分泌科， 2腎內科， 湖北 武漢 430000)

糖尿病是以胰島素分泌或活性障礙引起的持續(xù)性高血糖為特征的一種代謝失調性慢性疾病，并伴有多個器官的功能異常的并發(fā)癥，其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為其最常見的并發(fā)癥之一[1]。血液中長期高糖(high glucose，HG)環(huán)境可誘導腎小球系膜細胞凋亡，造成的系膜細胞的缺失是糖尿病導致腎損傷的主要病理機制[2]。近期研究發(fā)現黃芩中一種黃酮類有效成分黃芩苷(baicalin)具有良好的腎臟保護作用，且在治療DN中發(fā)揮重要作用[3]，然而，黃芩苷治療DN的作用機制尚未完全闡明。

沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，Sirt1)為第3類組蛋白脫乙酰酶，在許多高糖相關炎癥性疾病中是一種關鍵的調控因子。近年來研究表明，Sirt1可以通過調節(jié)高糖環(huán)境下腎臟細胞的氧化應激狀態(tài)，抑制腎臟細胞凋亡和腎臟炎癥反應，從而緩解糖尿病腎病的發(fā)展[4]。微小RNA(micro-RNA，miRNA，miR)是一種非編碼小RNA分子，在多種生理過程中發(fā)揮作用，包括細胞分化、增殖和凋亡等[5]。此外，miRNA被廣泛認為對多種疾病具有調控作用，包括糖尿病腎病。通過靶基因預測軟件(microRNA.org)預測Sirt1存在的miRNA，得到Sirt1的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)含有miR-141的結合位點。因此，本研究擬通過研究黃芩苷對高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞內miR-141及其靶基因Sirt1的表達水平及細胞凋亡的影響，深入闡釋黃芩苷對糖尿病引發(fā)的腎病的治療機制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠腎小球系膜細胞系SV40-MES-13購自上海酶聯生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen；miR-141 mimic(用于過表達miR-141)、miR-141 inhibitor(用于抑制miR-141表達)、si-Sirt1(用于抑制Sirt1表達)、pcDNA-Sirt1(用于過表達Sirt1)以及各自對照物均購自上海吉瑪制藥技術有限公司； RNeasy試劑盒購自Qiagen； Reverse Transcription System Kit購自TaKaRa；mirVanaTMRT-qPCR miRNA Detection Kit購自Ambion； BCA蛋白分析試劑盒和細胞溶解緩沖液購自Beyotime。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)、轉染與分組 小鼠腎小球系膜細胞系SV40-MES-13接種于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%～90%時，根據Lipofectamine 2000試劑說明書，將miR-141 mimic、miR-141 inhibitor、si-Sirt1、pcDNA-Sirt1以及各自對照物轉染進細胞。本實驗細胞分組如下：正常對照(control)組：培養(yǎng)基中加入5.5 mmol/L葡萄糖；HG組：培養(yǎng)基中加入25 mmol/L葡萄糖；黃芩苷組：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L黃芩苷以及5.5 mmol/L葡萄糖；HG+黃芩苷組：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L黃芩苷以及25 mmol/L葡萄糖。

2.2miR-141表達水平的檢測 采用qPCR檢測miR-141表達水平，RNeasy試劑盒提取細胞內總RNA，利用Reverse Transcription System Kit將RNA逆轉錄合成cDNA,在ABI 7500 PRISM 7500檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)里，以cDNA為模板，利用mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit進行qPCR檢測miR-141表達水平。每個實驗重復3次。所有操作均嚴格按照試劑盒附帶的說明書進行。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min; 95 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s， 72 ℃延伸30 s， 共40個循環(huán)。引物序列如下：miR-141上游引物序列為5’-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列為5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3Sirt1蛋白水平的檢測 將各組細胞收集后，在細胞溶解緩沖液中置于冰上孵育30 min。細胞裂解液經過離心機12 000 r/min離心5 min，收集上清液用BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度。取等量的蛋白樣品行10%SDS-PAGE，轉至PVDF膜上，后用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入Ⅰ抗(1∶2 000)在4 ℃孵育過夜。加入Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。ECL化學發(fā)光，采用HRP Developer圖像軟件顯影，利用Laserdensitometer分析軟件進行定量分析。

2.4Sirt1與miR-141調控關系的分析 雙螢光素酶實驗用于檢測Sirt1與miR-141的調控關系。通過生物信息學預測工具(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)預測出miR-141與Sirt1存在結合位點。將Sirt1野生型片段和突變型片段(miR-141與Sirt1的結合位點已被突變)克隆至pmirGLO雙螢光素酶報告質粒上，重組報告質粒分別命名為pmirGLO-Sirt1-WT和pmirGLO-Sirt1-MUT。將重組報告質粒分別與miR-141 inhibitor或miR-141 mimic共轉染至SV40-MES-13細胞中。轉染24 h后，收集細胞利用雙螢光素酶基因報告系統(tǒng)檢測各組螢光素酶相對活性，再將數據進行統(tǒng)計與分析。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)48 h后，通過500～1 000 r/min離心5 min，收集細胞。PBS清洗后，加入Annexin V-FITC和PI染液，4 ℃避光染色5 min。在FACSVerse流式細胞儀(Becton-Dickinson)通過熒光激活細胞分選儀檢測細胞凋亡水平。

3 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理和統(tǒng)計分析。所有實驗都重復3次，采用均數±標準差(mean±SD)來表示所有結果。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 黃芩苷對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞miR-141和Sirt1表達及細胞凋亡的影響

Western blot實驗結果顯示，與control組相比，SV40-MES-13細胞經過高糖處理后，Sirt1蛋白水平明顯下調，說明高糖抑制SV40-MES-13細胞細胞內Sirt1表達；相比于25 mmol/L組，黃芩苷與高糖共同處理SV40-MES-13細胞后Sirt1水平明顯提高(P<0.01),見圖1A。qPCR結果顯示HG組miR-141的表達水平顯著高于control組，黃芩苷可以逆轉高糖引起的miR-141水平升高(P<0.01),見圖1B。此外，高糖處理引起SV40-MES-13細胞凋亡水平顯著升高，黃芩苷可大大抑制高糖引起SV40-MES-13細胞凋亡(P<0.01),見圖1C。黃芩苷單獨處理SV40-MES-13細胞并不會對Sirt1、miR-141表達和細胞凋亡水平產生明顯影響。

Figure 1. The effects of baicalin and high glucose (HG) on mouse glomerular mesangial cells. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖1黃芩苷對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞miR-141和Sirt1表達及細胞凋亡的影響

2 敲減miR-141抑制高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡

為了驗證miR-141和高糖之間的關系，我們用不同濃度(5.5和25 mmol/L)的葡萄糖處理SV40-MES-13細胞, qPCR結果顯示，HG組miR-141的表達水平明顯高于control組(P<0.01)，說明高糖環(huán)境促進miR-141的表達水平升高; SV40-MES-13細胞轉染miR-141 inhibitor后經過高糖處理，實驗結果顯示miR-141水平下調(P<0.01)可以抑制高糖誘導的SV40-MES-13細胞凋亡(P<0.01),見圖2。

3 Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一

為了驗證Sirt1與miR-141調控關系，本研究首先通過生物信息在線軟件預測miR-141在Sirt1 3’UTR區(qū)存在結合位點，見圖3A。雙螢光素酶報告分析結果顯示miR-141 inhibitor與重組報告質粒共轉染SV40-MES-13細胞，顯著提高了野生型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-WT)的活性(P<0.01)，但是對突變型Sirt1 3’UTR(Sirt1 3’UTR-MUT)活性沒有產生影響；miR-141 inhibitor轉染至SV40-MES-13細胞后，Sirt1 mRNA和蛋白水平顯著提高(P<0.01),見圖3B。此外，miR-141 mimic與重組報告質粒共轉染SV40-MES-13細胞，顯著抑制了野生型Sirt1 3’UTR的活性，但是對突變型Sirt1 3’UTR活性沒有產生明顯影響;同時通過向SV40-MES-13細胞轉染miR-141 mimic過表達miR-141，Sirt1 mRNA和蛋白水平明顯受到抑制(P<0.01),見圖3C。上述結果提示Sirt1是miR-141直接作用的靶基因之一。

4 敲減miR-141表達通過上調Sirt1抑制高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞凋亡

為了進一步驗證高糖環(huán)境、miR-141/Sirt1和小鼠腎小球系膜細胞凋亡三者之間的關系，我們通過向SV40-MES-13細胞轉染miR-141 inhibitor或轉染miR-141 inhibitor+siRNA-Sirt1再經過高糖處理，觀察miR-141/Sirt1水平改變對鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響。結果顯示，高糖引起細胞內Sirt1蛋白水平下降和細胞凋亡水平上升；干擾miR-141表達可以逆轉高糖引起的Sirt1蛋白水平下降和細胞凋亡水平上升；干擾miR-141對Sirt1蛋白水平和細胞凋亡的作用可以進一步被Sirt1水平的下調所逆轉，見圖4。這一結果表明，干擾miR-141通過上調Sirt1抑制高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡。

Figure 2. Knock-dowm of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG). A: miR-141 expression was detected by qPCR; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs25 mmol/L+miR-NC group.

圖2干擾miR-141抑制高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡

Figure 3. miR-141 directly regulated Sirt1. A: the binding sites between miR-141 and Sirt1 3’UTR; B: miR-141 inhibitor enhanced the luciferase activity of wild-type (WT) Sirt1 3’UTR and increased the mRNA and protein expression of Sirt1; C: miR-141 mimic inhibited the luciferase activity of WT Sirt1 3’UTR and decreased the mRNA and protein expression of Sirt1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmiR-NC group;##P<0.01vspre-NC group.

圖3Sirt1受到miR-141靶向調控

Figure 4. Knock-down of miR-141 expression inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) through upregulating Sirt1. A: the protein expression of Sirt1 was determined by Western blot; B: miR-141 expression was detected by qPCR; C: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+miR-141 inhibitor+si-control group.

圖4干擾miR-141通過上調Sirt1抑制高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞凋亡

5 黃芩苷通過影響miR-141上調Sirt1抑制高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞凋亡

為了驗證黃芩苷對高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細胞的影響，我們通過SV40-MES-13細胞轉染miR-141 mimic或轉染miR-141 mimic+pcDNA-Sirt1再經過高糖和黃芩苷處理，觀察黃芩苷對鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響。結果顯示，黃芩苷可以抑制高糖引起的細胞內Sirt1蛋白水平下降和細胞凋亡水平上升；過表達miR-141可以逆轉黃芩苷抑制高糖對Sirt1蛋白水平和細胞凋亡的作用；過表達miR-141對鼠腎小球系膜細胞的作用可以進一步被Sirt1的過表達所逆轉，見圖5。這一結果表明黃芩苷通過影響miR-141上調Sirt1抑制高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞凋亡。

討 論

DN是最常見的病理性代謝紊亂(糖尿病)誘發(fā)的末期腎病，其發(fā)病機理錯綜復雜，尚未完全闡明[6-7]。糖尿病腎病早期形態(tài)學變化包括腎小球肥大、系膜擴張和腎小球基膜損傷，這些造成了腎小球屏障功能失調也促進了DN病理的發(fā)展[8-10]。此外，研究表明由于高糖更易誘導腎小球系膜細胞凋亡，因此腎小球系膜細胞損傷造成的腎小球病變在DN病理過程中發(fā)揮關鍵的作用[2]。本研究發(fā)現高糖可明顯誘導腎小球系膜細胞凋亡。黃芩苷為黃芩中一類黃酮類有效成分，其具有抗過敏、抗氧化、抗炎及抑制細胞凋亡等功效[11]，從而發(fā)揮對生物機體的保護作用。據研究報道，黃芩苷通過抗氧化和抗炎作用可有效緩解丙酮醛引起的細胞毒性和緩解大鼠的糖尿病腎病[12]；此外，黃芩苷可通過抑制H2O2誘導氧化應激緩解終板軟骨細胞凋亡[13]，同時研究表明黃芩苷通過下調凋亡相關蛋白水平抑制腎臟細胞凋亡，從而起到保護腎臟作用[3]。本研究發(fā)現加入黃芩苷處理后腎小球系膜細胞凋亡明顯得到抑制，由此說明黃芩苷可緩解高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡，但具體機制仍需要進一步研究。

Figure 5. Baicalin inhibited the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells induced by high glucose (HG) via miR-141/Sirt1 signaling pathway. A: the protein expression of Sirt1; B: the apoptosis of mouse glomerular mesangial cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;&&P<0.01vsHG+baicalin+pre-NC group;△△P<0.01vsHG+baicalin+miR-141 mimic+pcDNA group.

圖5黃芩苷通過影響miR-141上調Sirt1抑制高糖誘導小鼠腎小球系膜細胞凋亡

Sirt1是一種依賴NAD+型脫乙酰酶，主要調控能量約束的下游途徑有利于維持糖穩(wěn)態(tài)，同時其還參與調控細胞凋亡、分化和衰老以及調控糖和脂類的代謝。Sirt1被發(fā)現在糖尿病小鼠三叉感覺神經元中表達下調[14]。研究報道，缺氧條件下，在成骨細胞中過表達Sirt1使細胞內的凋亡蛋白表達下降，從而抑制缺氧引起的細胞凋亡[15]。白藜蘆醇通過激活Sirt1活性，使核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)脫去乙酰基激活整個信號通路，引發(fā)caspase-3介導的凋亡機制，最終引起軟骨肉瘤細胞凋亡[16]。因此這些表明Sirt1在細胞凋亡中扮演著重要角色。本研究中腎小球系膜細胞凋亡與Sirt1密切相關，在高糖誘導下，Sirt1的表達水平明顯降低，并伴隨著細胞凋亡水平增加。此外，干擾Sirt1在腎小球系膜細胞中表達可以促進細胞凋亡。

越來越多的證據表明miRNAs在Sirt1有關的凋亡途徑中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明多種mi-RNAs通過直接靶向作用于Sirt1而調控細胞的生理過程。在腫瘤研究中，Sirt1可被上游分子miR-138靶向下調從而抑制肝癌細胞的增殖[17]和抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[18]，以及miR-200a可以通過靶向結合Sirt1誘導腎癌細胞凋亡[19]。在糖尿病狀態(tài)下，miR-34a靶向結合Sirt1，從而負向下調Sirt1/HIF-1α信號途徑促進耳蝸毛細胞凋亡，引發(fā)糖尿病患者聽力障礙[20]。Sirt1的3’-UTR存在miR-211的結合位點，并受其靶向下調誘導晶狀體上皮細胞凋亡，介導糖尿病白內障的發(fā)展[21]。此外，據報道m(xù)iR-141作為調控子也涉及參與糖尿病的病理過程[22]。本研究發(fā)現miR-141在高糖環(huán)境下的小鼠腎小球系膜細胞中表達明顯上調，通過對其表達的抑制可有效緩解高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡，并且通過雙螢光素酶實驗證明，Sirt1是miR-141介導細胞凋亡的下游調控的靶分子之一。

綜上所述，本研究表明高糖條件(模擬糖尿病環(huán)境)下小鼠腎小球系膜細胞中miR-141表達水平上調，Sirt1表達受到抑制，造成小鼠腎小球系膜細胞凋亡。黃芩苷可以通過抑制miR-141過表達，促進Sirt1表達水平上升，最終緩解高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡，達到治療糖尿病腎病的作用。