李美霞, 張菡菡
(1濱州醫(yī)學(xué)院, 山東 煙臺 264003; 2高青縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科, 山東 高青 256300)
子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一,為起源于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤,目前在臨床上以手術(shù)治療為主,但晚期和轉(zhuǎn)移患者可選治療措施較少,主要依賴化療,而化療副作用是導(dǎo)致患者治療失敗的主要問題。因此,探尋更為低毒有效的治療藥物是目前子宮內(nèi)膜癌治療的一大需求。
千金藤素(cepharanthine,CEP)提取自傳統(tǒng)中藥千金藤,是一類異喹啉類生物堿[1],具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定質(zhì)膜、抗炎及增強腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[2]等作用。越來越多的研究顯示,千金藤素在對抗腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦有著重要作用,千金藤素可以促進包括人類白血病細(xì)胞系[3]、膽管癌細(xì)胞[4]和口腔鱗癌細(xì)胞[5]等多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡。
微小RNA(microRNA, miRNA, miR)是一類長約22 nt的非編碼RNA,廣泛存在于真核生物中, 主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控[6-7]。 miRNA可以與其靶基因mRNA分子的3’ 端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)互補配對結(jié)合,進而引起該mRNA的翻譯抑制或者降解,是一種天然的RNAi 誘導(dǎo)分子[8]。有報道顯示,用人工miRNA引發(fā)靶向目的基因的RNA干擾(RNA interference,RNAi),比shRNA的抑制效率更高,因此miRNA被作為抑制腫瘤等疾病相關(guān)基因的潛在療法。本實驗室前期研究結(jié)果證實,千金藤素可以通過抑制miR-150和miR-182的表達而分別上調(diào)p53和FOXO1,從而抑制肺癌A549細(xì)胞的生長,促進其凋亡[9],提示我們千金藤素可以通過影響miRNA的表達來實現(xiàn)對下游癌基因和抑癌基因的調(diào)控,miRNA可能是千金藤素在體內(nèi)發(fā)揮抗癌作用的靶點。本實驗研究了千金藤素對人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞活力和凋亡的影響,并檢測了細(xì)胞內(nèi)miR-215的變化,探討千金藤素能否通過調(diào)節(jié)miR-215的表達來進一步影響人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長。
人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈。miR-215由上海吉瑪公司合成;千金藤素、DMSO和MTT購自Sigma;DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;miRNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa;兔抗人真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)及p-eIF4E單克隆抗體購自BioWorld;羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。
2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出RL-952細(xì)胞,迅速放入37 ℃溫水中快速搖動使其融化,離心后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照每孔5.0×103個的密度接種于96孔板,24 h后棄去孔中舊培養(yǎng)基,將稀釋好的千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的濃度來處理細(xì)胞,每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。24 h 后每孔加入100 μL含10% MTT的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h,后吸棄上清,每孔加入100 μL DMSO,避光振蕩10 min,酶標(biāo)儀中選取490 nm波長檢測,讀取各孔吸光度(A)值。計算公式如下:細(xì)胞活力抑制率=1-A實驗組/A對照組。
2.3流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照每孔2.0×105個的密度接種于6孔板,24 h后用千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的濃度來處理細(xì)胞,藥物作用24 h后,胰酶消化收集細(xì)胞后,用無菌PBS洗滌細(xì)胞2次,離心后收集細(xì)胞沉淀,每管加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞后,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,再加入5 μL propidium iodide(PI)混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。
2.4Real-time PCR檢測最佳有效濃度的千金藤素作用后miR-215的表達 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板,24 h后用30 μmol/L千金藤素處理細(xì)胞,胰酶消化收集細(xì)胞后,應(yīng)用RNAiso for Small RNA 提取細(xì)胞總小RNA,然后進行加尾、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA, real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-215的表達情況,5S rRNA作為反應(yīng)內(nèi)參照。miR-215的上游引物序列為5’-ATGACCTATGATTTGACAG-3’, 5S rRNA的上游引物序列為5’-GCCATACCACCCTGAACG-3’, 通用下游引物序列為5’-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’。Real-time PCR為20 μL體系,反應(yīng)條件為:95 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,重復(fù)40個循環(huán)。60 ℃至95 ℃繪制熔解曲線。
2.5Western blot 檢測千金藤素對eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影響 取對數(shù)生長期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板,千金藤素(30 μmol/L)加入孔中,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,加入RIPA提取細(xì)胞總蛋白,按照每孔40 μg的上樣量加入濃縮膠孔開始電泳, 電壓80 V,至樣品遷移至濃縮膠與分離膠交界處時,改為100 V,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,7%封閉液封閉2 h,洗膜后加I 抗4 ℃封閉過夜,洗膜,加II 抗封閉2 h,曝光顯影并拍照。
2.6熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP表達情況 實驗共分為4組,分別為空白對照(blank control)組、陰性對照(negative control,NC)組、pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(GFP-eIF4E-3’UTR)組和pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215共轉(zhuǎn)染(miR-215)組。取對數(shù)生長期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板,除空白對照組外,后3組用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染1 μg negative control mimics、1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR質(zhì)粒及1 μg miR-215 mimics和1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR質(zhì)粒,6~8 h后換液,48 h后熒光倒置顯微鏡下觀察各組熒光強度并拍照,拍照結(jié)束后,收集各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組GFP表達情況。
2.7Western blot檢測miR-215轉(zhuǎn)染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗分為3組:正常對照組、陰性對照組和miR-215轉(zhuǎn)染組。取對數(shù)生長期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板,miR-215轉(zhuǎn)染組和陰性對照組分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-215 mimics和negative control mimics入細(xì)胞,6~8 h后換液,48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白,行Western blot檢測,步驟如前。
運用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
分別采用0、10、20、30和40 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞后,細(xì)胞活力的抑制率均明顯升高(P<0.01),并呈一定的劑量依賴性,達到30 μmol/L后再增大藥物濃度,細(xì)胞活力的抑制率不再升高,提示此濃度可作為最佳有效濃度來進行后續(xù)實驗,見圖1。
Figure 1. The effect of CEP on the viability of RL-952 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖1MTT法檢測不同濃度千金藤素對RL-952細(xì)胞活力的影響
光鏡下可見,不同濃度的千金藤素處理RL-952細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,細(xì)胞皺縮、變圓、脫壁,懸浮死細(xì)胞增多,見圖2。
Figure 2. The morphological changes of RL-952 cells treated with CEP at different concentrations observed under inverted microscrope (×100).
圖2倒置顯微鏡下觀察不同濃度千金藤素對RL-952細(xì)胞形態(tài)的影響
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,千金藤素處理細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P<0.01),可見千金藤素可以誘導(dǎo)RL-952細(xì)胞凋亡,見圖3。
Figure 3. The effect of CEP on the apoptotic rate of RL-952 cells analysis by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度千金藤素對RL-95細(xì)胞凋亡的影響
30 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞24 h后,miR-215的表達水平較對照組顯著升高(P<0.01),提示該濃度的千金藤素可有效上調(diào)RL-952細(xì)胞中miR-215的表達,見圖4。miR-215在子宮內(nèi)膜癌中具有抑癌基因的功能,千金藤素誘導(dǎo)的RL-952細(xì)胞凋亡可能通過升高miR-215的表達來實現(xiàn)。
30 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞48 h后,Western blot結(jié)果顯示藥物處理組eIF4E/GAPDH和p-eIF4E/GAPDH均較對照組降低(P<0.05或P<0.01),見圖5。
Figure 4. The effect of CEP on the expression of miR-215 in the RL-952 cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖4Real-timePCR檢測千金藤素對RL-952細(xì)胞miR-215表達的影響
Figure 5. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖5Westernblot檢測千金藤素作用后eIF4E及p-eIF4E的表達結(jié)果
通過microrna.org(http://www.microrna.org/)生物信息學(xué)軟件預(yù)測,顯示eIF4E的3’UTR存在miR-215的結(jié)合位點,見圖6。
Figure 6. The result of bioinformatic analysis to predict target genes of miR-215 by software searching.
圖6生物信息學(xué)軟件預(yù)測eIF4E為miR-215的靶基因
檢測GFP表達以觀察miR-215對pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR的調(diào)控作用。熒光顯微鏡顯示,pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215轉(zhuǎn)染組熒光強度較陰性對照組和單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯減弱,見圖7A;流式細(xì)胞術(shù)檢測pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215轉(zhuǎn)染組GFP陽性率為7.85%,與陰性對照組和單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(P<0.05),見圖7B。以上結(jié)果提示eIF4E為miR-215的靶基因,miR-215可有效下調(diào)eIF4E的表達。
Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組和陰性對照組相比,miR-215轉(zhuǎn)染組p-eIF4E表達顯著降低(P<0.01),eIF4E表達亦降低(P<0.05),見圖8。
千金藤素具有抗炎、抗多藥耐藥、治療銀屑病和增強腫瘤細(xì)胞放化療敏感性等作用,且未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床毒副作用,其在多種腫瘤中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn),但尚未見到子宮內(nèi)膜癌中的作用研究報道。本研究的結(jié)果證實,千金藤素可抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的增殖,促進其凋亡,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,這提示千金藤素可以作為臨床子宮內(nèi)膜癌治療的潛在藥物。
本研究嘗試從miRNA角度入手進一步研究其機制。miRNA在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演癌基因或者抑癌基因的重要角色。已有報道顯示,miR-215在結(jié)直腸腫瘤[10]和非小細(xì)胞肺癌[11]等腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用,而在胃癌[12]和宮頸癌[13]等組織中則發(fā)揮著癌基因的作用。關(guān)于miR-215在子宮內(nèi)膜癌中的作用,Karaayvaz等[14]的結(jié)果顯示,miR-215在48例子宮內(nèi)膜癌中的表達和癌旁組織中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而Gao等[15]的報道則顯示miR-215通過下調(diào)LEFTY2促進了HEC-1A細(xì)胞的EMT和增殖過程。本研究結(jié)果顯示,有效濃度的千金藤素作用后,miR-215表達上調(diào),而生物信息學(xué)軟件分析得到癌基因eIF4E的3’UTR存在miR-215的結(jié)合位點,因此我們推測千金藤素對子宮內(nèi)膜癌增殖和凋亡的影響可能是通過影響了miR-215進而下調(diào)了eIF4E的表達而實現(xiàn)的。
eIF4E是真核生物翻譯起始復(fù)合物eIF4F復(fù)合體(eIFR3、eIF4A 和eIF4G)的一部分,是真核翻譯起始復(fù)合物最有效的成分之一;另外,eIF4E還調(diào)控著mRNA從細(xì)胞核向核糖體的輸出[16-17],這些都是啟動翻譯的關(guān)鍵步驟,因此eIF4E在蛋白質(zhì)翻譯起始階段起著有效的調(diào)控作用,其過表達或激活所導(dǎo)致的翻譯失調(diào)和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為一種新型原癌基因,eIF4E在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。2011年Choi等[18]第一次報道了eIF4E在子宮內(nèi)膜癌中高表達,且與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期呈正相關(guān),應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)eIF4E表達可有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)有效濃度的千金藤素作用于RL-952細(xì)胞后,eIF4E及其活性形式p-eIF4E表達均有下調(diào), 提示eIF4E可能是千金藤素下游的靶基因。我們進而將人工合成的miR-215作用于RL-952細(xì)胞后,同樣看到了eIF4E及其磷酸化形式p-eIF4E的下調(diào)。結(jié)合上述real-time PCR結(jié)果,我們得到以下結(jié)論,千金藤素可有效抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的活力,并促進其凋亡,其機制主要通過上調(diào)miR-215的表達,進而抑制eIF4E及其活性形式p-eIF4E的表達來實現(xiàn)。這為千金藤素作為臨床子宮內(nèi)膜癌的輔助治療藥物提供了理論依據(jù)。
Figure 7. The expression of GFP detected by fluorescence microscropy (A) and flow cytometry (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.
圖7熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP表達
Figure 8. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E after miR-215 transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖8Westernblot檢測miR-215轉(zhuǎn)染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平