周 晗， 梁若龍， 王晗月， 胡巢鳳

(暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系， 國家中醫(yī)藥管理局病理生理學實驗室， 廣東 廣州 510632)

自噬是一個受自噬相關基因嚴密調控的復雜的動態(tài)過程，基礎水平的自噬是維持細胞內穩(wěn)態(tài)的必要條件，然而自噬失調會打破細胞原有的平衡狀態(tài)，引發(fā)多種疾病的產生，如炎癥、腫瘤和神經退行性疾病等[1-2]。營養(yǎng)缺乏、損傷、變性蛋白聚集和細胞器受損等應激情況可誘導自噬的發(fā)生，細胞中大量游離的單層或雙層膜結構聚集，包繞在待降解物的周圍，形成分隔膜，完全包繞待降解的細胞器、蛋白質形成雙層膜的自噬體。細胞骨架微管系統(tǒng)將成熟的自噬體運輸至溶酶體，二者融合形成自噬性溶酶體；自噬體內容物在溶酶體蛋白水解酶的作用下消化、降解，細胞吸收并重新利用這些降解產物。該過程中出現的自噬體是自噬發(fā)生的典型特征[3]。

受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，Rip)是一類重要的信號轉導因子，通過與腫瘤壞死因子受體相互作用，介導下游核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路, 誘導炎癥反應和凋亡。Rip2屬于Rip家族成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，位于胞漿，在抵抗多種病原體入侵機體的過程中發(fā)揮重要的作用[4]。我們前期的研究發(fā)現，Rip2能誘導人胰腺癌細胞株Panc-1凋亡[5]。Rip2是否能直接誘導自噬至今未見報道。因此，本實驗主要研究過表達Rip2對Panc-1細胞自噬的影響及其作用機制，為胰腺癌治療尋找新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

Panc-1細胞由中山大學中山醫(yī)學院惠贈。pEGFP-Rip2重組質粒由本課題組構建；胎牛血清及DMEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco；轉染試劑jetPRIME購自Polyplus；抗Rip2多克隆抗體購自Santa Cruz；抗微管相關蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、beclin-1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt和GAPDH抗體均購自CST。

2 方法

2.1Panc-1細胞培養(yǎng)及質粒轉染 Panc-1細胞用10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。以每孔3×105個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，第2天進行質粒轉染。將Panc-1細胞分為對照(control)組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，未給予任何處理； pEGFP-C2空質粒(pEGFP-C2)組：轉染pEGFP-C2空質粒6 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)42 h；pEGFP-Rip2重組質粒(pEGFP-Rip2)組：轉染pEGFP-Rip2重組質粒6 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)42 h。

2.2Western blot檢測蛋白表達 用含0.25% EDTA的胰酶消化細胞，收集Panc-1細胞，用預冷的PBS洗滌2次，向細胞沉淀加入RIPA裂解液100 μL和1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，吹打混勻，置于冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min, 收集上清, 并轉移到EP中。提取蛋白后吸取少量蛋白提取液, 用BCA蛋白定量測定試劑盒進行蛋白濃度的測定。

用SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜上，再置于封閉液中進行封閉1 h, 加Ⅰ抗體，4 ℃冰箱孵育12～16 h。滴加Ⅱ抗，TBST洗膜，曝光，用灰度分析軟件對目的條帶進行分析。

2.3透射電鏡觀察細胞內自噬體的數量 將細胞接種于6孔板培養(yǎng)，按照上面的分組對細胞進行基因轉染。用細胞刮刀收集細胞樣本，經過戊二醛-鋨酸固定、梯度乙醇-丙酮脫水、浸透、Epon812包埋、高溫聚合、修塊、半薄切片、染色、定位、超薄切片和醋酸鈾-檸檬酸鉛染色等過程，將細胞樣本制作成為超薄切片，置于透射電子顯微鏡下，觀察細胞內自噬體的變化并拍照記錄。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0軟件對實驗結果數據進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 重組質粒轉染前后Rip2蛋白的表達

pEGFP-C2空質粒和pEGFP-Rip2重組質粒分別轉染Panc-1細胞48 h后，Western blot檢測結果顯示，與對照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組細胞的Rip2蛋白表達明顯增多(P<0.01)；而對照組與pEGFP-C2組相比，Rip2蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義,見圖1。實驗結果證明pEGFP-Rip2重組質粒成功轉入細胞，并且上調細胞內Rip2蛋白的表達。

2 Rip2對自噬相關蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ表達的影響

與對照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組細胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；而對照組和pEGFP-C2組比較，beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 1. The expression of the Rip2 protein in Panc-1cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1各組Panc-1細胞Rip2蛋白的表達

3 透射電子顯微鏡觀察各組細胞內自噬體的變化情況

pEGFP-C2空質粒和pEGFP-Rip2重組質粒分別轉染Panc-1細胞48 h后，在透射電子顯微鏡下觀察細胞內自噬體的變化情況。對照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組的細胞內均可見自噬體，但對照組和pEGFP-C2組僅見少量自噬體，而pEGFP-Rip2組細胞內自噬體的數量明顯增加,見圖3。這一結果證明過表達Rip2可誘導Panc-1細胞發(fā)生自噬。

4 Rip2抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR通路的活化

pEGFP-Rip2組細胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明顯低于對照組和pEGFP-C2組(均P<0.01)；而對照組和pEGFP-C2組相比，p-Akt和p-mTOR蛋白水平的差異無統(tǒng)計學顯著性； 各組總Akt和mTOR蛋白的水平未見明顯變化,見圖4。這一結果說明Rip2可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化。

Figure 2. The effect of Rip2 overexpression on the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2過表達Rip2對Panc-1細胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

討 論

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著促進和抑制的雙重作用，它既可以作為一種防御機制保護受損的細胞抵抗惡劣生存環(huán)境，促進細胞的生存，又可以在腫瘤細胞無法維持自身生存時誘導細胞自噬性死亡，對細胞產生殺傷性作用。自噬活性的變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[6]。

大量文獻報道Rip2與固有免疫、適應性免疫和炎癥反應有密切關系，其中也有報道其與細胞凋亡和增殖有關[7]。那么，過表達Rip2是否對自噬有影響？Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳動物中的同源基因，它通過與激活PI3K形成復合物來調控其他自噬相關蛋白在自噬體膜上的定位和前自噬體的形成，是誘發(fā)細胞自噬的關鍵基因之一[8-9]。Beclin1基因是第一個確認的哺乳動物的自噬基因，也是第一個確認的在自噬溶酶體降解途徑中起腫瘤抑制的基因，對自噬體的形成至關重要[10]。LC3是定位于自噬體膜上的標記蛋白，有 LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 2種形式。LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定的存在于自噬體膜上，被當做自噬體的標記，并且LC3-Ⅱ的表達水平可以在一定程度上反映自噬體的數量[11]。我們通過Westernblot檢測各組Panc-1細胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達情況。結果顯示pEGFP-Rip2組細胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯高于對照組和pEGFP-C2組，提示過表達Rip2可誘導Panc-1細胞發(fā)生自噬。

Figure 3. The changes of autophagosomes in Panc-1 cells under TEM (×8 900). A: control; B: pEGFP-C2; C: pEGFP-Rip2. M: mitochondrion; N: nucleus; arrow(→): autophagosomes

圖3透射電子顯微鏡下觀察Panc-1細胞內自噬體的變化情況

自噬體的形成是自噬過程中的關鍵步驟，因此，自噬的檢測方法主要包括基于檢測自噬體的直接(觀察自噬體的數量及形態(tài))和間接(檢測自噬體的表面標記蛋白)方法。透射電子顯微鏡下觀察到雙層膜結構的自噬體是檢測自噬的金標準，也是觀察細胞自噬最直接、最經典的方法。因此，為了進一步驗證過表達Rip2對Panc-1細胞自噬水平的影響，我們收集各組細胞并制作成超薄切片，在透射電鏡下觀察細胞內自噬體的變化情況。結果顯示對照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組的細胞內均有自噬體形成，但pEGFP-Rip2組細胞內自噬體的數量明顯多于對照組和pEGFP-C2組。因此證明過表達Rip2可直接誘導Panc-1細胞發(fā)生自噬。

細胞自噬的調控涉及多種復雜的信號通路，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路在調控細胞自噬活性中發(fā)揮關鍵作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，受營養(yǎng)狀況、生長因子和ATP等多種因素變化的影響，可使其下游靶蛋白發(fā)生磷酸化，調節(jié)基因轉錄、蛋白表達和調控自噬。研究發(fā)現，生長因子等通過受體酪氨酸激酶活化Ⅰ型PI3K，催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)， PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1)結合, 促使PDK1磷酸化Akt導致Akt活化，從而激活mTOR, 抑制自噬[12-13]。

Figure 4. The effect of Rip2 overexpression on the levels of p-Akt and p-mTOR proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4過表達Rip2對Panc-1細胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平的影響

為了探究Rip2誘導自噬是否與PI3K/Akt/mTOR通路相關，我們應用Western blot檢測各組細胞內p-Akt蛋白的水平。結果顯示pEGFP-Rip2組細胞的p-Akt蛋白水平明顯低于對照組和pEGFP-C2組，而各組總Akt蛋白表達未見明顯變化。隨后，我們又檢測了Akt下游p-mTOR蛋白水平的變化，發(fā)現pEGFP-Rip2組細胞p-mTOR的蛋白水平明顯低于對照組和pEGFP-C2組，而各組總mTOR蛋白水平無明顯變化。以上結果說明過表達Rip2可誘導Panc-1細胞發(fā)生自噬，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有關。

綜上所述，Rip2能夠誘導Panc-1細胞發(fā)生自噬；其作用機制可能與Rip2下調磷酸化Akt和mTOR的蛋白水平，進而抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有關。隨著進一步探討Rip2誘導自噬的作用機制，將為臨床治療胰腺癌及其他腫瘤尋找新的靶點提供實驗依據。