莊文越， 李正祎， 劉 燕， 夏 薇△， 陳子興

(1北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 2吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院， 吉林 吉林 132013； 3蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 江蘇省血液學(xué)研究所， 江蘇 蘇州 215000)

近年來，丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)被發(fā)現(xiàn)具有抑制組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)活性的作用，屬于HDAC抑制劑(HDAC inhibitor，HDACI)的短鏈脂肪酸類，可通過抑制HDAC的作用，使核小體組蛋白乙酰化，逆轉(zhuǎn)HDAC參與的異常基因表達(dá)，從而引起廣泛的抗腫瘤效應(yīng)，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)機(jī)體對化療和放療的敏感性及逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的惡性表型等[1-2]。為研究AML1-ETO融合蛋白的致白血病機(jī)理，我們前期將AML1-ETO融合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入白血病細(xì)胞株U937中，并以染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，ChIP)等技術(shù)已確認(rèn)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,CEBPA)基因是AML1-ETO融合蛋白結(jié)合的直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄的下游基因之一。AML1-ETO融合蛋白通過修飾組蛋白的乙酰化和甲基化使CEBPA基因沉默，從而改變了U937-A/E細(xì)胞的增殖分化表型[3]。本研究以急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)U937-A/E細(xì)胞株為模型，研究VPA對AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CEBPA基因表觀遺傳修飾的調(diào)控，探討VPA誘導(dǎo)沉默的CEBPA基因再表達(dá)的可能機(jī)制，為表觀遺傳學(xué)調(diào)控治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

蛋白酶抑制劑混合物、RNase、VPA、蛋白酶K和CCK-8試劑盒均購自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Thermo Scientific；ChIP kit及抗乙?；M蛋白H3(acetylated histone H3, AcH3)和AcH4 抗體均購自Millipore。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

將本室構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AML1-ETO的亞克隆細(xì)胞株命名為U937-A/E1～4，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；將轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)的U937細(xì)胞命名為U937-Mock，設(shè)為空載體組；U937-WT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，為無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的野生型U937細(xì)胞，設(shè)為空白對照組。細(xì)胞以5×106/L的密度接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液傳代。實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期的細(xì)胞，用不同濃度(0.1、0.5、1.0和2.0 mmol/L)的VPA分別處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h，以不加藥物組作為對照組，收集細(xì)胞并洗滌，進(jìn)行相關(guān)檢測。

3 主要方法

3.1CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種單細(xì)胞懸液于96孔板，每孔100 μL(含8 000個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，不同處理時(shí)間后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在450 nm波長下，酶聯(lián)免疫分析儀測定各孔吸光度(A)，按照公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。以抑制率為縱坐標(biāo)，以藥物濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

3.2臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔4×105個(gè)接種于6孔板，給予不同濃度VPA(0.1、0.5、1.0和2.0 mmol/L)作用不同時(shí)間(24 h、48 h和72 h)，用濃度為0.1%的臺盼藍(lán)染色，3 min內(nèi)用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成藍(lán)色， 而活細(xì)胞拒染。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原 取對數(shù)生長期的U937-WT、U937-Mock和U937-A/E1～4細(xì)胞2×105個(gè)，每次每組設(shè)2孔，相同條件下重復(fù)3次，加PE-CD11b和FITC-CD14單抗，4 ℃培育30 min，PBS洗滌2次，用200 μL PBS混懸。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)檢測，CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析結(jié)果。

3.4RT-qPCR檢測藥物處理前后CEBPA mRNA的表達(dá)變化 首先應(yīng)用Invitrogen的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。用SYBR Green染料法在ABI 7500型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。CEBPA的上游引物序列為5’-CTTCAACGACGAGTTCCTGGCCGA-3’；下游引物序列為5’-AGCTGCTTGGCTTCATCCTCCT-3’。β-actin的上游引物序列為5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’,下游引物序列為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算CEBPA的 mRNA相對表達(dá)量。

3.5ChIP-qPCR方法檢測藥物處理前后CEBPA基因組蛋白H3和H4的乙?；癄顟B(tài) 收集1×108細(xì)胞加入終濃度體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醛溶液，室溫?fù)u床孵育10 min，加入1/20體積的2.5 mol/L的甘氨酸，室溫?fù)u床孵育5 min后，4 ℃、400×g離心5 min，收集細(xì)胞用1×PBS洗2遍，細(xì)胞碎片用ChIP lysis buffer (Affymetrix)重懸，超聲得到染色體平均大小為500 bp，利用抗AcH3和抗AcH4 抗體，按照Millipore的ChIP具體步驟操作。ChIP沉淀富集的樣本，以CEBPA基因啟動子區(qū)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物如下：上游引物5’-TGGACAAGAACAGCAACGAG-3’，下游引物5’-TTGTCACTGGTCAGCTCCAG-3’。ChIP沉淀富集的DNA用SYBR Green染料方法進(jìn)行real-time PCR分析。有效數(shù)據(jù)的判斷：(1)各樣品的擴(kuò)增曲線須達(dá)到平臺期；(2)熔解曲線為單一的峰，并且熔解溫度在75 ℃以上才能提示該擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增。ChIP-qPCR的結(jié)果按%Input=2-ΔCt(normalized ChIP)公式處理數(shù)據(jù)，其中ΔCt(normalized ChIP)=Ct(ChIP)-[Ct(Input)-log2(Input Dilution Factor)]，Input Dilution Factor= (fraction of the input chromatin saved)-1。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。定量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩獨(dú)立樣本之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VPA對U937及AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法結(jié)果表明，1.0 mmol/L及以上濃度的VPA在不同時(shí)點(diǎn)檢測的細(xì)胞抑制率均有顯著差異(P<0.05)；在同一時(shí)點(diǎn)，不同濃度下的細(xì)胞抑制率之間有明顯差異(P<0.05)，隨著濃度的增加，VPA的增殖抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，見圖1A。在活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況與對照組相比明顯受到抑制, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中以VPA 1.0 mmol/L為藥物濃度組、48 h為作用時(shí)間進(jìn)行分析。

Figure 1. The effect of VPA on the proliferation of U937 andAML1-ETOtransfected cells. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0.1 mmol/L group;*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1VPA對U937及AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的影響

2 VPA誘導(dǎo)細(xì)胞髓系分化抗原的表達(dá)改變

CD11b和CD14是髓系標(biāo)志，表達(dá)于較成熟的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。上述各組細(xì)胞經(jīng)1.0 mmol/L VPA培養(yǎng)48 h后，亞克隆細(xì)胞株間的CD11b和CD14表達(dá)陽性率相互比較，顯示AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞株U937-A/E1～4的CD11b和CD14表達(dá)陽性率均顯著低于U937-Mock和U937-WT細(xì)胞(P<0.05)，這與藥物處理前的分化抗原表達(dá)下降趨勢是一致的。同時(shí)，藥物處理后，與對照未加藥組比較，CD11b和CD14的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of VPA on the expression of CD11b and CD14 in the U937 andAML1-ETOtransfected cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsVPA-untreated group;△P<0.05vsU937-Mock or U937-WT.

圖2VPA對U937及AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD11b和CD14表達(dá)的影響

3 VPA對CEBPA mRNA表達(dá)水平的影響

采用RT-qPCR檢測處理組和對照組細(xì)胞中CEBPA mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，經(jīng)1.0 mmol/L VPA作用48 h后U937-A/E1～4各細(xì)胞株中，與對照組比較，VPA均明顯上調(diào)CEBPA mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effect of VPA on mRNA expression of CEBPA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3VPA對CEBPAmRNA表達(dá)水平的影響

4 VPA作用前后CEBPA基因啟動子表觀遺傳修飾的檢測結(jié)果

用VPA處理細(xì)胞后，與藥物處理前比較，CEBPA基因啟動子區(qū)核染色質(zhì)的組蛋白H3和H4乙酰化水平升高(P<0.05)； 同時(shí)，VPA處理細(xì)胞后，各細(xì)胞株間比較發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞U937-A/E1～4的CEBPA啟動子區(qū)所在染色質(zhì)的H3及H4乙酰化水平均顯著低于U937-Mock及U937-WT細(xì)胞(P<0.05)，這些表觀遺傳學(xué)修飾的特征與藥物處理前是一致的，見圖4。

Figure 4. The effect of VPA on H3 and H4 acetylation ofCEBPAgene. A: H3 acetylation ofCEBPAgene; B: H4 acetylation ofCEBPAgene. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsVPA-untreated group;△P<0.05vsU937-Mock or U937-WT.

圖4VPA對CEBPA基因組蛋白H3和H4乙?；降挠绊?/p>

討 論

表觀遺傳修飾中組蛋白的乙?；腿ヒ阴；揎椩谡婧思?xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而組蛋白乙酰化是一個(gè)可逆的動態(tài)過程，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HATs)和HDACs這一對酶的相互平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；蔀樘囟ɑ虮磉_(dá)的切換開關(guān)[4]，它們的功能紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。腫瘤細(xì)胞中HDACs異?；罨蓪?dǎo)致一系列基因的轉(zhuǎn)錄受抑，所涉及的有與增殖調(diào)節(jié)、遷移、血管發(fā)生、細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因[5]。VPA作為一種廣泛應(yīng)用于臨床的廣譜抗癲癇藥物，是一種HDAC抑制劑，多項(xiàng)體外研究顯示其可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化與凋亡、導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯而抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖[6-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用CCK-8法觀察VPA對U937細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響, 在一定濃度范圍內(nèi)VPA隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長,抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量和時(shí)間依賴性，說明VPA可以抑制U937及其轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖。VPA在1.0 mmol/L分別作用48 h后可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞U937及其轉(zhuǎn)染了AML1-ETO的細(xì)胞發(fā)生分化。

在急性髓性白血病中，由于染色體易位t(8;21)和基因重排產(chǎn)生了新的融合基因AML1-ETO，其蛋白產(chǎn)物通過募集HDAC，使在造血細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起重要作用的基因表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致白血病的發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)，VPA能特異性誘導(dǎo)AML1-ETO陽性細(xì)胞系(Kasumi-1和Kasumi-6)分化，繼而誘導(dǎo)凋亡并上調(diào)AML1目的基因的表達(dá)，但在AML1-ETO陰性細(xì)胞系MV4-11和K562未觀察到上述變化[10]。Insinga等[11]研究證明，VPA能提高AML1-ETO、PML-RARα陽性AML患者及小鼠骨髓原始細(xì)胞組蛋白乙?；?，通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體及Fas死亡受體途徑誘導(dǎo)凋亡。C/EBPα蛋白是造血系統(tǒng)中調(diào)控髓系分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在造血分化早期階段對造血干祖細(xì)胞分化命運(yùn)的選擇起決定作用。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO轉(zhuǎn)染各細(xì)胞株中，CEBPA mRNA普遍處于低表達(dá)狀態(tài)，使分化阻滯，導(dǎo)致白血病的發(fā)生[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究深入探討VPA作為組蛋白去乙?；敢种苿ML1-ETO陽性細(xì)胞中CEBPA基因表達(dá)及表觀遺傳修飾的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用VPA可明顯上調(diào)CEBPA mRNA的表達(dá)水平，VPA處理組U937及AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CEBPA啟動子區(qū)的組蛋白H3和H4的乙?；缴?。由此證明，VPA能夠在一定程度上使M2b型白血病細(xì)胞因染色質(zhì)組蛋白低乙酰化而轉(zhuǎn)錄失活的CEBPA基因恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，CEBPA mRNA得以重新表達(dá)，從而能夠發(fā)揮抗凋亡、促分化和腫瘤抑制的作用。

綜上所述，HDAC抑制劑VPA對U937及其AML1-ETO轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有生長抑制和促分化的作用，并且通過提高CEBPA基因的組蛋白乙?；绞乖臼芤值腃EBPA基因在M2b型白血病細(xì)胞中重新表達(dá)或表達(dá)增加，通過人為的干預(yù)拮抗，甚至逆轉(zhuǎn)異常的表觀遺傳學(xué)改變，誘導(dǎo)因表觀遺傳學(xué)改變而失活的基因重新表達(dá)。這一機(jī)理提供了表觀遺傳學(xué)調(diào)控治療腫瘤的理論基礎(chǔ)，為白血病的基因靶向治療開辟了新的途徑。