賈亞楠， 王可可， 王思思， 廖曉敏， 封慕茵， 袁建玲， 邵鐘銘， 揭 偉， 申志華△

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理生理教研室， 2病理學(xué)系， 廣東 湛江 524023)

腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)是影響鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。前期報(bào)道發(fā)現(xiàn)部分基因表達(dá)異常與NPC的細(xì)胞生物學(xué)行為有關(guān)[1-7]，但目前對(duì)NPC侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不甚清楚。因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和鑒定參與NPC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要靶基因，仍然是NPC防治研究的重要內(nèi)容。特殊富含AT序列結(jié)合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1)是一種核基質(zhì)結(jié)合蛋白，1992年由Dickinson等[8]發(fā)現(xiàn)。SATB1可特異性地與核基質(zhì)區(qū)相結(jié)合，影響DNA環(huán)的構(gòu)建，參與染色體重塑、組蛋白乙酰化和甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾過程，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[9]。SATB1 的異常表達(dá)與人類多種腫瘤臨床進(jìn)展關(guān)系密切[10-13]。我們前期也發(fā)現(xiàn)SATB1高表達(dá)可以促進(jìn)NPC的臨床進(jìn)展[14]，但確切機(jī)制仍有待闡明。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的重要機(jī)制之一[15]，NPC中也存在EMT過程。我們前期證實(shí)[16]，干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路可通過逆轉(zhuǎn)EMT減弱NPC的肺轉(zhuǎn)移，提示靶向EMT在NPC治療上具有潛在價(jià)值。本研究擬在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析NPC中SATB1是否通過調(diào)節(jié)EMT而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系及臨床標(biāo)本

NPC細(xì)胞系CNE1、CNE2Z及C666-1均為我室保存。76 例NPC及61例鼻咽黏膜慢性炎癥(nasopharyngeal chronic inflammation，NPI)患者的石蠟包埋組織來自2011～2015年廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理中心保存的標(biāo)本。所有NPC患者均為首次就診，未接受任何治療，組織學(xué)類型均為非角型未分化性癌，采用pTNM系統(tǒng)(AJCC/UICC 2002)進(jìn)行分類。76例NPC患者中，男性25例，女性51例，中位年齡45歲；61例NPI為同期標(biāo)本，其中男性36例，女性25例，中位年齡46歲。臨床人體標(biāo)本的使用符合廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院有關(guān)倫理學(xué)規(guī)定(倫理學(xué)批件編號(hào)為PJ2014028)。

2 主要試劑及儀器

兔抗人SATB1抗體(Novus)；鼠抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和波型蛋白(vimentin)抗體(Cell Signaling)；鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz)；HRP或FITC標(biāo)記的 II 抗(武漢三鷹)；SATB1特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(廣州銳博)；RNA抽提試劑盒、RT-PCR試劑盒和Lipofectamine 3000(Invitrogen)；定量PCR試劑盒(Roche)；PCR引物由上海生工公司合成；免疫組化PV9000試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；蛋白酶及磷酸酶抑制劑、RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒(江蘇碧云天)；ECL發(fā)光劑及PVDF膜(Thermo Fisher Scientific)。定量PCR儀(Roche)；激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5 II，Leica)；凝膠成像分析系統(tǒng)(北京天能)；蛋白電泳儀(Bio-Rad)等。

3 方法

3.1免疫組化 參考既往方法[4, 14, 16]采用PV9000法檢測(cè)上述臨床標(biāo)本中SATB1、E-cadherin及vimentin蛋白的表達(dá)。SATB1、E-cadherin和Vimentin I抗按1 ∶100稀釋。SATB1表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，按陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，<10%為1分，≥10%但<50%為2分，≥50%為3分；按顯色程度評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。E-cadherin和vimentin表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，按陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，<25%為1分，≥25%但<50%為2分，≥50%但<75%為3分, ≥75%為4分；按顯色程度評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。結(jié)果判斷采用免疫反應(yīng)積分(immunoreactive scores, IRS)標(biāo)準(zhǔn)，IRS=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分，兩者總分≥6分為SATB1高表達(dá)，總分≥3分為E-cadherin和vimentin高表達(dá)。

3.2細(xì)胞培養(yǎng) 參考既往方法[5-7]進(jìn)行。高分化CNE1、低分化CNE2Z和未分化C666-1細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.3siRNA轉(zhuǎn)染 參考既往方法[14]進(jìn)行。采用2對(duì)SATB1特異性siRNA組成cocktail進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。siRNA序列如下：si-SATB1-1的正義鏈為5’-GGAUAGUCUUUCUGAGCUAdTdT-3’，反義鏈為5’-UAGCUCAGAAAGACUAUCCdTdT-3’；si-SATB1-2 的正義鏈為5’-GCUGAAAGAGACCGAAUAUdTdT-3’，反義鏈為5’-AUAUUCGGUCUCUUUCAGCdTdT-3’。采用無關(guān)序列作為陰性對(duì)照(siRNA-NC, Cat. #siB05815，廣州銳博)。轉(zhuǎn)染前 1 d，將CNE1、CNE2Z和C666-1細(xì)胞接種于 6/24孔板，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，待細(xì)胞融合度達(dá)60～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA濃度為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下通過觀察Cy3標(biāo)記的siRNA-NC組熒光來判斷轉(zhuǎn)染效率，于預(yù)定時(shí)點(diǎn)收獲細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.4RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR 采用既往方法[17-18]進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR反應(yīng)。SATB1的上游引物序列為5’-CTGGGCTCGTATCAACACCTAT-3’，下游引物序列為5’-TAAGGACTGCTGGGCTAAAAGT-3’；E-cadherin的上游引物序列為5’-TTGCTACTGGAACAGGGACAC-3’，下游引物序列為5’-CCCGTGTGTTAGTTCTGCTGT-3’；vimentin的上游引物序列為5’-TGCGTGAAATGGAAG AGAACT-3’，下游引物序列為5’-TCAGGTTTCAGGGAGGAAAAGT-3’；β-actin的上游引物序列為5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游引物序列為5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。PCR參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s， 共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法判斷目的基因mRNA的表達(dá)水平。

3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，取50 μg蛋白用于SDS-PAGE。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后加入I抗(SATB1， 1∶500； E-cadherin， 1∶1 000； vimentin， 1∶1 000； β-actin， 1∶3 000)4 ℃過夜孵育，TBST洗滌，HRP標(biāo)記的IgG (1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得目的蛋白條帶。

3.6免疫熒光染色 參考既往采用的間接免疫熒光法[19-20]檢測(cè)CNE1、CNE2Z及C666-1這3種細(xì)胞中SATB1蛋白的表達(dá)。SATB1抗原定位以FITC標(biāo)記的IgG顯示，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

3.7Transwell遷移實(shí)驗(yàn) Transwell小室置于24孔板。siRNA轉(zhuǎn)染的C666-1細(xì)胞(48 h)用含0.5%胎牛血清的DMEM重懸，取2×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室上室，體積為200 μL； Transwell小室下室中加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μL，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后取出小室并用10%中性甲醛固定15 min，伊紅染液染色5 min，用棉簽小心擦除小室上室面細(xì)胞，PBS洗滌后在顯微鏡物鏡下觀察并拍照。以穿膜的細(xì)胞數(shù)差異代表細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變。每張膜選3個(gè)典型視野，計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)3孔。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。臨床標(biāo)本中SATB1、E-cadherin和vimentin表達(dá)計(jì)算IRS積分后采用非配對(duì)資料t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 臨床標(biāo)本中免疫組化檢測(cè)結(jié)果及相關(guān)性分析

對(duì)76例NPC和61例對(duì)照NPI組織進(jìn)行SATB1、膜E-cadherin和vimentin的免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示，NPC中SATB1、膜E-cadherin和vimentin的IRS與NPI相比顯著改變(P<0.01)，見圖1A～C。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，NPC中SATB1與膜E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.146，P=0.264)，與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.358，P=0.009)，而vimentin與膜E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.207，P=0.029)，見圖1D～F。

2 NPC中SATB1和EMT標(biāo)志基因的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

76例NPC中SATB1高表達(dá)41例(53.95%)，與NPI對(duì)照組(11.48%)比較顯著升高(P<0.001)。進(jìn)一步分層研究顯示，SATB1高表達(dá)與NPC患者的年齡、性別、臨床分期和N分期無關(guān)，但與T分期和M分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。61例NPI中均表達(dá)膜E-cadherin(100%)，而NPC中膜E-cadherin表達(dá)下降(25/76，32.89%)，差異有顯著性(P<0.001)，同時(shí)有38例NPC腫瘤細(xì)胞可見胞質(zhì)E-cadherin著色。分層研究顯示，膜E-cadherin表達(dá)與NPC患者年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期和M分期均無關(guān)。在NPI中上皮細(xì)胞vimentin均為陰性(0/61，0%)，而間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)陽性；NPC中除間質(zhì)成分外，部分腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)也表達(dá)vimentin(39/61，63.93%)。Vimentin高表達(dá)與NPC患者年齡、性別、臨床分期、T分期和N分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，與M分期呈正相關(guān)(P=0.026)，見圖2及表1。

Figure 1. The protein expression of SATB1, membrane E-cadherin and vimentin in clinical samples of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and nasopharyngeal chronic inflammation (NPI) and the correlations. IRS of SATB1, membrane E-cadherin and vimentin in clinical samples of NPC and NPI were counted, and then unpairedttest (A～C) and Pearson correlation (D～F) were used for statistical analysis.**P<0.01vsNPI group.

圖1SATB1、膜E-cadherin和vimentin在臨床NPC及NPI標(biāo)本中的表達(dá)及相關(guān)性分析

Figure 2. The representative images of SATB1, E-cadherin and vimentin protein expression in NPC and NPI samples (×200).

圖2臨床NPC及NPI組織中SATB1、膜E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)結(jié)果

表1NPC臨床標(biāo)本中SATB1、膜E-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)及與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性

Table 1. The expression of SATB1, membrane E-cadherin (E-cad) and vimentin in clinical samples and the correlations with NPC clinical parameters

Clinical parameternSATB1≥6<6PMembrane E-cad≥3<3PVimentin≥3<3PHistological type NPC764135<0.0012551<0.0013937<0.001 NPI61754610061Sex Male2513120.8127180.52514110.567 Female51282318332526Age ≥50 years3321120.13812210.57315180.371 <50 years43202313302419Clinical classification Ⅰ～Ⅱ10460.499370.999460.511 Ⅲ～Ⅳ66372922443531T classification T1～T2196130.0245140.4819100.691 T3～T457352220373027N classification N0～N12313100.7678150.8188150.058 N2～N353282517363122M classification M07035350.02825450.16933370.026 M16600660

3 不同分化狀態(tài)的NPC細(xì)胞中SATB1的表達(dá)

分別對(duì)不同分化狀態(tài)的NPC細(xì)胞進(jìn)行SATB1表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平，CNE1細(xì)胞中的SATB1表達(dá)水平最低，而CNE2Z和C666-1細(xì)胞中的SATB1表達(dá)水平逐漸增加，見圖3A、B。免疫熒光觀察結(jié)果顯示，CNE1和CNE2Z中SATB1以胞質(zhì)陽性為主，而C666-1中出現(xiàn)明顯胞核陽性，見圖3C。鑒于C666-1細(xì)胞中的SATB1表達(dá)水平最高，我們后續(xù)以C666-1細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)一步分析干擾SATB1后對(duì)細(xì)胞EMT和遷移能力的影響。

4 siRNA對(duì)C666-1細(xì)胞的影響

本研究采用2對(duì)siRNA組成cocktail來保證干擾的效果。結(jié)果顯示，高表達(dá)SATB1的C666-1細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染SATB1特異性siRNA 48 h后，SATB1的mRNA水平下降90%以上，見圖4A；同時(shí)EMT相關(guān)分子E-cadherin和vimentin的mRNA及蛋白均有明顯的改變，表現(xiàn)為E-cadherin水平增加和vimentin水平下降(P<0.01),見圖4B～D。

5 SATB1干擾后細(xì)胞遷移能力的變化

采用Transwell實(shí)驗(yàn)分析干擾SATB1后對(duì)C666-1細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，干擾SATB1 24 h后穿過8 μm孔徑PVDF膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，見圖5。

討 論

SATB1高表達(dá)在較多的人類腫瘤中得以報(bào)道。2008年，Han等[21]報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞中改變SATB1表達(dá)將導(dǎo)致超過1 000個(gè)下游基因表達(dá)的改變，這些表達(dá)顯著改變的基因大多數(shù)涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)形成及下游重要信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)功能。由此涌現(xiàn)了較多有關(guān)SATB1與腫瘤關(guān)系的研究。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SATB1高表達(dá)可促進(jìn)人類消化系統(tǒng)腫瘤[10]、生殖系統(tǒng)腫瘤[12-13, 22]、泌尿系統(tǒng)腫瘤[23]和黑色素瘤[24]等多種惡性腫瘤的進(jìn)展；也有少部分相反的報(bào)道認(rèn)為SATB1丟失與腫瘤預(yù)后關(guān)聯(lián)密切[25-26]。因此，這些矛盾結(jié)果的存在促使我們對(duì)NPC中SATB1的表達(dá)進(jìn)行更深入的研究。

Figure 3. The expression of SATB1 in the NPC cell lines with various differential status. Highly differentiated CNE cells, poorly differentiated CNE2Z cells and undifferentiated C666-1 cells were regularly cultured, and SATB1 expression was examined by real-time PCR (A), Western blot (B) and immunofluorescence staining (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 CNE1 group;#P<0.05,##P<0.01vsCNE2Z group.

圖3SATB1在不同分化NPC細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 4. The changes of SATB1 and EMT-related molecule expression after interfering withSATB1 in the C666-1 cells. Real-time PCR (A～C) and Western blot (D) were used to detect the changes of SATB1, E-cadherin and vimentin in the C666-1 cells transfected withSATB1 specific siRNA and control siRNA (NC). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖4干擾C666-1細(xì)胞中SATB1表達(dá)及對(duì)EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響

Figure 5. The migration ability of C666-1 cells after interfering withSATB1 (×200). Mean±SD.n= 9.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖5干擾SATB1表達(dá)對(duì)C666-1細(xì)胞遷移能力的影響

我們既往研究已經(jīng)提示SATB1高表達(dá)與NPC的臨床進(jìn)展呈正相關(guān)，且SATB1高表達(dá)與EB病毒編碼的潛伏膜蛋白有關(guān)[14]。本研究再次證實(shí)，在臨床NPC樣本中SATB1表達(dá)以胞核為主，SATB1高表達(dá)與NPC患者的T分期和M分期呈正相關(guān)，且與NPC中膜E-cadherin的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，初步提示NPC中SATB1高表達(dá)可能通過EMT途徑參與NPC進(jìn)展。隨后，對(duì)不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞系進(jìn)行SATB1表達(dá)的篩查，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞分化程度的下降，SATB1表達(dá)水平升高，尤以C666-1細(xì)胞表達(dá)明顯。在表達(dá)方式上，CNE1和CNE2Z細(xì)胞中均以胞質(zhì)表達(dá)為主，而C666-1細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的胞核表達(dá)，這提示SATB1表達(dá)方式的不同可能導(dǎo)致其生物學(xué)功能各異。有報(bào)道認(rèn)為，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中SATB1表達(dá)的核/質(zhì)比增加與患者的預(yù)后相關(guān)[27]，盡管我們沒有分析臨床NPC樣本中SATB1表達(dá)的核/質(zhì)比，但這一結(jié)論與我們所觀察到的不同分化狀態(tài)NPC細(xì)胞系中SATB1的表達(dá)趨勢(shì)相吻合。

SATB1最早作為細(xì)胞核基質(zhì)結(jié)合蛋白而被鑒定[1]，隨后逐漸發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞EMT作用[28-31]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT即指上皮源性腫瘤細(xì)胞獲得間葉源性細(xì)胞表型，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)下降，而間葉源性細(xì)胞標(biāo)志物如vimentin和N-cadherin等表達(dá)卻上升，細(xì)胞同質(zhì)黏附能力下降，侵襲運(yùn)動(dòng)及轉(zhuǎn)移能力增加。2012年Tu等[31]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中SATB1過表達(dá)通過調(diào)節(jié)Snail、Slug和Twist 表達(dá)進(jìn)而影響vimentin和E-cadherin表達(dá)而參與EMT過程。隨后，在膀胱癌[28]、結(jié)直腸癌[29]和前列腺癌[30]等多種類型惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有相似的作用。本研究證實(shí)，在臨床NPC樣本中，SATB1高表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin表達(dá)呈正相關(guān)；隨后以SATB1高表達(dá)的C666-1細(xì)胞為對(duì)象，采用siRNA干擾SATB1表達(dá)后，我們觀察到明顯的E-cadherin表達(dá)上升和vimentin表達(dá)的下降；最后從功能上證實(shí)抑制SATB1后能顯著減弱SATB1高表達(dá)細(xì)胞C666-1的遷移能力。此外，我們應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)完全敲除了C666-1細(xì)胞中SATB1表達(dá)后，C666-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞骨架分布的改變，也伴隨相應(yīng)的遷移運(yùn)動(dòng)能力下降(未發(fā)表資料)。由此可見，NPC中SATB1高表達(dá)可以通過EMT機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NPC中SATB1高表達(dá)與患者的臨床進(jìn)展正相關(guān)，其機(jī)制可能與SATB1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT有關(guān)。本研究豐富了NPC發(fā)病機(jī)制學(xué)說。后期待補(bǔ)充動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。