劉 丹， 舒申友， 李 珂， 舒 璇， 董澤君， 郎 興

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院燒傷整形外科， 廣東 汕頭 515041)

非綜合征型單純性腭裂(nonsyndromic cleft pa-late only，NSCPO)是一種先天性缺陷病，嚴(yán)重影響人們的健康及生活質(zhì)量。目前NSCPO的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，已證實基因突變和環(huán)境影響都是NSCPO的復(fù)雜病因[1-2]。大量研究表明DNA甲基化對維持細(xì)胞正常功能、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生有重要作用，因作用位點較廣且調(diào)控結(jié)果可逆、可遺傳等特性而受到關(guān)注。Rogers等[3]的研究表明，對妊娠第10天(gestational day 10, GD10)的雌性孕鼠給予高劑量的DNA去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷時，胚鼠腭裂的頻率變高。Bulut等[4]注意到，在GD11和GD14向小鼠施用5-氮雜胞苷(5-氮雜-2’-脫氧胞苷的核苷類似物)時出現(xiàn)多種先天性發(fā)育畸形，其中就包括腭裂，提示該化合物的去甲基化作用對早期胚胎發(fā)育具有易感性。因此本研究使用高效低成本全基因組DNA甲基化檢測技術(shù)——甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶測序(methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,MethylRAD-Seq)法對不同時段的腭裂模型組和正常對照組小鼠腭胚組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化測序，比較基因組不同元件中甲基化位點的差異分布及甲基化水平的差異基因，對甲基化位點的位置信息進(jìn)行注釋，并對差異甲基化位點相關(guān)基因和甲基化差異基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，篩選與胚鼠腭裂形成相關(guān)基因及信號通路，為進(jìn)一步闡明NSCPO的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)一步實驗，提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級C57BL/J小鼠動物許可證編號為SCXK(京)2012-0001(北京維通利華公司)，飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物房，8～10 周齡，體重22～28 g，飼養(yǎng)溫度(25±2) ℃，人工調(diào)控晝夜循環(huán)，自由進(jìn)飲進(jìn)食。

2 主要試劑

全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)(Sigma)；玉米油(中糧集團(tuán))。

3 主要方法

3.1構(gòu)建維甲酸誘導(dǎo)的胚鼠腭裂模型 將70 mg ATRA溶于10 mL 玉米油中,配制濃度為7 g/L的ATRA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗?dāng)天中午12:00以2∶1雌雄合籠，次日晨8:00將雌雄鼠分籠飼養(yǎng)，雌鼠均視為疑似受孕，記為GD0.5。雌鼠隨機(jī)編號，稱體重并記錄。在GD10.5 晨 8:00 時依次稱量雌鼠體重，觀察腹部明顯膨隆且體重增加大于2.5 g者視為實驗孕鼠，其余視為假孕并繼續(xù)以同法合籠交配，共得到的實驗孕鼠18只，隨機(jī)分3組(A、 B和C組)，每組6只；每組再分成2小組，每小組3只，比如A組包括A1、A2、A3、a1、a2和a3，其中A為模型組，a為對照組。所有模型組(A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3)在GD10.5分別給予管飼ATRA (70 mg/kg)，對照組(a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2和c3)在GD10.5給予管飼玉米油(0.20 mL/kg)。

3.2樣本的獲取及保存 分別于GD13.5、14.5和16.5使用脫頸法處死模型組及對照組小鼠,無菌操作，在顯微鏡下解剖摘取胚鼠口腔內(nèi)的腭突組織，新鮮腭突組織標(biāo)本取下立即放入無菌凍存管并置于液氮凍存(來自同1個孕鼠的所有腭突組織作為1例樣本)。

3.3全基因組DNA甲基化測序 采用QIAamp DNA Mini Kit 法提取組織樣本DNA,并采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA純度，18個樣本委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測。MethylRAD-Seq法是利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶(FspE I)對基因組DNA進(jìn)行酶切，F(xiàn)spE I可以識別DNA上甲基化位點，把FspE I的識別位點標(biāo)識為CCGG和CCWGG，其中簡并堿基W代表堿基A和T，在識別位置的下游隔一定位置進(jìn)行酶切，如果DNA 2條鏈的甲基化狀態(tài)是對稱的，那么就可以切割產(chǎn)生一個固定長度的片段(32 bp)，這些片段給予合適的接頭序列(adaptor)連接后進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建成帶有樣本特異性條紋碼序列(barcode sequence)的文庫。18個樣品的標(biāo)簽序列文庫在Hiseq X Ten平臺進(jìn)行高通量測序，得到原始測序序列(Raw Data)。原始測序序列經(jīng)過濾刪除含有接頭序列的Reads及低質(zhì)量Reads，使用Pear 0.9.6軟件拼接后，最后過濾刪除含有N堿基的序列得到Clean Data。參考基因組序列數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/mus_musculus/dna/Mus_musculus.GRCm38.dna.toplevel.fa.gz)，從C57BL/J小鼠基因組序列中提取所有的CCGG和CCWGG位點，建立標(biāo)簽對比的參考序列。最后利用SOAP 2.21軟件將這些高質(zhì)量的MethylRAD測序標(biāo)簽比對到構(gòu)建的CmCGG和CmCWGG位點的參考序列上(參數(shù)設(shè)置為：-M4-v 2-r0)唯一位置的序列，進(jìn)行全基因組DNA甲基化水平的檢測，將測序深度不低于3的位點判定為可靠的甲基化位點。最后將測得的3個時段有差異甲基化位點所在的基因及甲基化差異基因都導(dǎo)入DAVID基因功能分析平臺進(jìn)行GO和 KEGG通路分析，對基因的功能及信號通路進(jìn)行注釋。

結(jié) 果

1 甲基化位點的數(shù)量及甲基化水平的比較

根據(jù)等長標(biāo)簽擴(kuò)增效率的一致性，甲基化標(biāo)簽的測序深度可以反映位點的甲基化水平。以測序深度不低于3的位點判定為可靠的甲基化位點，考慮到參考序列中存在重復(fù)區(qū)，位于重復(fù)區(qū)的Reads能夠同時比對到參考序列的多個位置，對于這種甲基化位點的實際發(fā)生位置難以進(jìn)行判斷，鑒于此，在進(jìn)行比對時，不考慮重復(fù)比對的Reads，18個文庫的Enzyme Reads (Clean Reads 質(zhì)控后含有預(yù)期酶切位點的Reads)能比對到參考序列唯一位置的比對率見表1。根據(jù)這18個樣本的全基因組DNA甲基化的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析了每個樣本的甲基化位點數(shù)量及平均測序深度，見表2。

表118個文庫的EnzymeReads比對到參考序列唯一位置的比對率

Table 1. The ratio of Enzyme Reads matching the alignment to the only position in the reference sequence

SampleClean ReadsEnzyme ReadsMapping ReadsRatioA1142,855,38380,720,50857,927,32571.76%A2142,855,38379,838,18659,697,33474.77%A3142,855,38378,129,09256,390,99572.18%B1131,029,92052,959,69138,391,98672.49%B2131,029,92056,224,18141,472,60573.76%B3131,029,92054,365,63438,595,47370.99%C1154,938,89169,209,73550,154,76972.47%C2116,896,71535,423,26724,085,45567.99%C3116,896,71544,807,99532,803,91173.21%a1116,896,71546,276,55434,624,76874.82%a2116,896,71542,914,10430,874,53171.94%a3142,855,38371,659,10652,037,53372.62%b1142,120,40259,873,38744,498,70374.32%b2142,120,40258,784,35842,436,66072.19%b3131,029,92042,987,51629,595,82668.85%c1154,938,89155,011,78437,939,28368.97%c2154,938,89168,822,66149,747,69972.28%c3154,938,89171,858,94053,483,39974.43%

表218個樣本甲基化位點平均測序深度

Table 2. The average sequencing depth of the methylation sites (CCGG and CCWGG) in 18 samples

SampleCCGG siteCCWGG siteSite numberMean depthSite numberMean depthA1812,06953.0991,6529.94A2869,98048.55105,9989.22A3837,89049.05108,1589.29B1752,15038.6057,5459.07B2815,02237.1250,8988.33B3770,02637.6555,4698.32C1818,90944.9369,6508.85C2742,80924.7449,2277.99C3736,46332.9953,1678.17a1784,09130.0750,5777.63a2761,07230.0856,4357.87a3850,65746.9394,7848.56b1823,50838.2978,5788.15b2790,14240.3269,1228.65b3767,88829.1657,2528.36c1828,04334.9165,3609.07c2800,21747.1763,6529.68c3860,56345.3474,8778.33

2 甲基化位點在基因元件的分布情況

使用SnpEff 4.3p軟件，根據(jù)注釋文件計算獲得非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)，使用bedtools 2.25.0軟件統(tǒng)計了18個樣本的甲基化位點在3’-UTR、5’-UTR、TSS2000(轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp內(nèi)的區(qū)域)、intron(內(nèi)含子區(qū))、exon(外顯子區(qū))和intergenic region (基因間區(qū))6個基因功能元件的甲基化位點數(shù)、分布特點及差異，甲基化位點數(shù)量在exon、intron和intergenic region這3個基因元件上的數(shù)量明顯多于3’-UTR、5’-UTR和TSS2000這3個元件，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The distribution and quantitative statistics of 18 samples of DNA methylation sites in 6 gene functional elements. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖118個樣本DNA甲基化位點在6個基因功能元件的分布及數(shù)量統(tǒng)計

3 差異甲基化位點在基因及染色體上的分布特點

以實驗時點分3組進(jìn)行比較，使用edgeR軟件計算各個位點在組間的差異P值及差異倍數(shù)log2FC并判斷甲基化水平變化趨勢，進(jìn)行統(tǒng)計檢驗后，將P<0.05且log2FC絕對值大于1的位點判定為差異甲基化位點。3個時點組的差異甲基化位點數(shù)量見表3，在不同基因功能元件上所占的比例見表4。從上述2個表中可見3個時點的差異甲基化位點都主要集中在內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)和外顯子區(qū)，組間比較無顯著差異。有差異的甲基化位點主要集中在CCGG位點上；從時間上比較，隨著時間推移，上調(diào)的差異甲基化位點數(shù)量明顯減少，下調(diào)的差異位點數(shù)量逐漸增加。差異甲基化位點在染色體上的分布可能是不均勻的，在基因組不同功能元件的差異甲基化位點分布表明，CCGG/CCWGG主要位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，見圖2。

表33個時點差異甲基化位點的數(shù)量統(tǒng)計

Table 3. The numbers of differential methylation sites at the 3 time points

GroupUp-regulated site numberDown-regulated site numberCCGG siteCCWGG siteCCGG siteCCWGG siteGD13.510 9571 6182 910864GD14.58 3431 0698 9551 294GD16.58817099 302871

表4 3個時點差異甲基化位點在基因功能元件上所占的比例

Figure 2. The distribution of differential methylation sites on chromosomes. A, C and E: CCGG methylation sites; B, D and F: CCWGG methylation sites. A and B: GD13.5; C and D: GD14.5; E and F: GD16.5. The methylation level up-regulation and down-regulation sites are expressed in brown and blue, respectively.

圖2差異甲基化位點在染色體上的分布圖

4 差異甲基化位點相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

對差異甲基化位點所在的基因進(jìn)行GO功能富集分析，對基因的功能進(jìn)行描述(結(jié)合GO注釋結(jié)果)，GO分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義從而挑選用于后續(xù)研究的基因。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異位點所在基因進(jìn)行通路分析(結(jié)合KEGG注釋結(jié)果)，通路分析對實驗結(jié)果有提示的作用，通過差異位點的基因進(jìn)行通路分析，可以找到差異位點的基因可能與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。我們統(tǒng)計并繪制了差異甲基化位點相關(guān)基因的GO功能富集前30項及KEGG通路前20項的富集圖，見圖3、4。

Figure 3. Differential methylation site-related genes analyzed by GO function enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖3差異甲基化位點相關(guān)基因的GO功能富集結(jié)果

5 甲基化差異基因的GO和KEGG富集分析

計算基因內(nèi)的所有位點測序深度總和，代表其基因的甲基化水平，而后進(jìn)行組間比較,分組同前。對模型組和對照組樣品進(jìn)行統(tǒng)計檢驗的基因，要求至少存在一個組，組內(nèi)所有樣品在基因的測序深度均高于3，對P<0.05且log2FC絕對值大于1的位點判定為差異基因。我們匯總了這些甲基化水平有差異的基因，統(tǒng)計了這些基因甲基化水平上、下調(diào)的信息，繪制了差異甲基化基因的數(shù)量統(tǒng)計表，見表5。最后將這些甲基化差異基因進(jìn)行GO功能富集和 KEGG信號通路富集分析，為尋找腭裂相關(guān)基因及通路提供數(shù)據(jù)依據(jù)。我們統(tǒng)計并繪制了甲基化差異基因GO功能富集的前30項及KEGG通路前20項的富集圖,見圖5、6。

6 腭裂形成相關(guān)的基因及信號通路

目前普遍認(rèn)為ATRA導(dǎo)致小鼠腭裂的發(fā)生機(jī)制主要有以下3點：(1)內(nèi)側(cè)邊緣上皮細(xì)胞的周皮細(xì)胞發(fā)生凋亡所致；(2)原舌肌及下頜骨在發(fā)育過程中相應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡所致；(3)抑制間充質(zhì)細(xì)胞的增殖所致。參照上述病因機(jī)制，本實驗選取了數(shù)個明顯GO富集結(jié)果和KEGG通路分析結(jié)果,并在其中挑取了6個有明顯差異的基因(Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53)，以及MAPK、Wnt和TGF-β信號通路作為下一步驗證對象,見表6。

Figure 4. Differential methylation site-related genes analyzed by KEGG pathway enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖4差異甲基化位點相關(guān)基因的KEGG通路富集結(jié)果

表5 3個時點差異甲基化基因的數(shù)量統(tǒng)計

Figure 5. Methylation differential genes analyzed by GO function enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖5甲基化差異基因的GO富集結(jié)果

討 論

表觀遺傳學(xué)與腭裂形成的相關(guān)性的研究最近幾年才開始引起關(guān)注，表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、microRNA、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼 RNA調(diào)控等。目前研究腭裂發(fā)生機(jī)制主要集中在基因突變和環(huán)境變化。遺傳改變被認(rèn)為可導(dǎo)致20%～25%的腭裂病例[5-6]，而解釋遺傳改變的一種機(jī)制是在胚胎發(fā)育過程中易感基因的異常甲基化，導(dǎo)致正常腭發(fā)育所必需的關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生改變，故查找腭裂疾病相關(guān)基因及探究其致病機(jī)制尤為迫切。

本實驗我們選用ATRA誘導(dǎo)的小鼠腭裂模型和MethylRAD-Seq技術(shù)。在腭裂疾病的基因研究中，常用到ATRA、地塞米松和TCDD(四氯二苯并-p-二噁英)等藥物誘導(dǎo)先天性小鼠腭裂模型。本實驗我們選用ATRA誘導(dǎo)C57BL小鼠，大量動物實驗證明此模型穩(wěn)定可靠[7]。MethylRAD-Seq技術(shù)是一種新開發(fā)的高效低成本的全基因組的DNA甲基化檢測技術(shù)[8]，可以對全基因組內(nèi)的甲基化位點進(jìn)行定量和定性分析，其原理主要是利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶(FspE I和MspJ I)對基因組DNA進(jìn)行酶切，基因組中CmCGG和CmCWGG位點上的甲基化修飾均可以被識別，酶切后產(chǎn)生具有核心甲基化位點的等長標(biāo)簽，對標(biāo)簽文庫再進(jìn)行高通量測序，最終獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點序列信息。根據(jù)等長標(biāo)簽擴(kuò)增效率的一致性，甲基化標(biāo)簽的測序深度可以反映位點(CmCGG/CmCWGG)的甲基化水平。已有研究利用基因組背景清晰的模式生物擬南芥，對MethylRAD-Seq技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)驗證[9]。結(jié)果表明，MethylRAD-Seq具有很好的技術(shù)重復(fù)性，假陽性率在0.5%以內(nèi)，可以檢測全基因組范圍內(nèi)胞嘧啶的甲基化水平，并且該方法可以評估基因組染色體區(qū)域的甲基化水平分布。該技術(shù)結(jié)合了甲基修飾依賴性內(nèi)切酶和簡化基因組限制性酶切分型技術(shù)的特點，在不需要基因組背景信息的前提下可以大規(guī)模挖掘全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點，直接獲得甲基化胞嘧啶的序列信息；既可以用于未知甲基化位點的開發(fā)，也可用于不同樣本間的甲基化位點的差異研究。

Figure 6. Methylation differential gene by KEGG pathway enrichment results. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖6甲基化差異基因的KEGG富集結(jié)果

表6 Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53基因注釋信息

FC: fold change; Chr: chromosome.

本實驗統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)了樣本的DNA差異甲基化位點主要分布在內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)和外顯子區(qū)。內(nèi)含子區(qū)域的差異甲基化位點占到了約39%，這可能是由于內(nèi)含子對翻譯轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無結(jié)構(gòu)意義，不受自然選擇的壓力，累積更多突變有關(guān)。與甲基化使基因表達(dá)降低的啟動子區(qū)相反，基因間區(qū)的甲基化水平傾向于與轉(zhuǎn)錄正相關(guān)[10]，基因間區(qū)的甲基化與轉(zhuǎn)錄的激活機(jī)制密切相關(guān)[11]。本次測序數(shù)據(jù)提示基因間區(qū)的差異甲基化位點占到了約40%。但DNA甲基化在基因間區(qū)內(nèi)的具體作用尚不清楚，組織特異性基因的基因間區(qū)中發(fā)生異常甲基化，是否可能減少轉(zhuǎn)錄或增加轉(zhuǎn)錄延伸；基因間區(qū)的甲基化修飾在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能上是否可部分替代啟動子的作用值得我們進(jìn)一步探究。通過對3組18個樣本測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)基因不同功能元件的甲基化位點的峰值個數(shù)和峰值在對照組無明顯變化，實驗組甲基化整體水平隨著時間推移逐漸降低；實驗組和對照組的CmCGG型甲基化位點都明顯多于CmCWGG型，而且CmCGG型的甲基化位點的甲基化測序深度明顯高于CmCWGG型，推斷基因組內(nèi)DNA發(fā)生甲基化的位點，仍主要集中在CpG-二核苷酸上。甲基化差異基因的分析證實了intron、exon和intergenic region這3個功能元件上甲基化差異基因數(shù)量明顯多于3’-UTR、5’-UTR和TSS2000，我們推測相關(guān)基因的異常甲基化可能是腭裂發(fā)生的重要原因。

關(guān)于腭裂與DNA甲基化的研究，相關(guān)甲基化差異基因篩選和驗證以及相關(guān)通路的調(diào)控機(jī)制將是非常重要的步驟。本實驗通過對3組18個樣本進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)3個組共計1 497個有差異甲基化表達(dá)的基因(P<0.05)，并進(jìn)行GO功能富集和 KEGG通路富集分析，結(jié)合胚鼠腭裂病理生理發(fā)生機(jī)制，篩選了腭裂形成相關(guān)的6個基因(Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53)；這些基因的差異甲基化位點主要位于exon、TSS2000、intron和intergenic region；結(jié)合這些基因?qū)?yīng)的GO注釋，本實驗發(fā)現(xiàn)Fgf16與GO:0005104(成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合的分子功能)和GO:0008543(成纖維細(xì)胞生長因子受體信號通路)密切相關(guān)；Jarid2與GO:0031061(組蛋白甲基化的負(fù)調(diào)控)、GO:0048863(干細(xì)胞分化)、GO:0042127(細(xì)胞增殖的調(diào)控)和GO:0016568(染色質(zhì)修飾)密切相關(guān)；Tbx22與GO:0005634(細(xì)胞核)、GO:0045892(以DNA為模板轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控)、GO:0000122(RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控)、GO:0003700(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性)、GO:0006351(以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄)和GO:0003677(DNA結(jié)合的分子功能)密切相關(guān)；Kdm6a與GO:0035097(組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體)、GO:0071557(組蛋白H3-K27去甲基化)、GO:0060070(經(jīng)典Wnt信號通路)、GO:0001701(子宮內(nèi)胚胎發(fā)育)和GO:0048333(中胚層細(xì)胞分化)密切相關(guān)；Nr3c1與GO:0031946(糖皮質(zhì)激素生物合成過程的調(diào)控)、GO:0016020(細(xì)胞膜)、GO:0005737(細(xì)胞質(zhì))、GO:0006355(以DNA為模板轉(zhuǎn)錄的調(diào)控)和GO:0016568(染色質(zhì)修飾)密切相關(guān)；Trp53與GO:0097371(MDM2/MDM4家族蛋白結(jié)合的分子功能)、GO:0034103(組織重塑的調(diào)控)、GO:0090343(細(xì)胞衰老的正調(diào)控)、GO:0035033(組蛋白脫乙酰酶的調(diào)控活性)、GO:0048568(胚胎器官發(fā)育)、GO:0009792(出生或卵孵化時胚胎發(fā)育終止)、GO:2000269(成纖維細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控)、GO:0035264(多細(xì)胞生物生長過程)和GO:0042981(凋亡過程的調(diào)控)密切相關(guān)。與腭裂形成相關(guān)的通路主要有MAPK、Wnt、TGF-β等信號通路，這些差異位點的功能富集主要集中在生長發(fā)育、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝等，推測小鼠腭裂的產(chǎn)生有表觀遺傳學(xué)的參與及調(diào)控。而這些通路與前人的研究有許多共通之處，一方面驗證了前人的研究，另一方面也為探究腭裂疾病與相關(guān)基因突變研究提供新的思路。很多實驗已證明腭間充質(zhì)細(xì)胞合成的蛋白多糖是腭支架升高的必要條件[12-14]。圍繞這一動態(tài)發(fā)育過程，后續(xù)我們可以從糖蛋白信號通路富集的基因中篩選出與腭裂形成的相關(guān)基因，進(jìn)行鑒定和功能驗證。NSCPO的病因是復(fù)雜的，涉及遺傳和環(huán)境因素，推測、鑒定基因和研究相關(guān)信號通路將是一項艱巨的任務(wù)。