殷倩倩， 馬東慎， 魏 瑜， 劉 慧

(徐州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002)

乳腺癌已成為中國(guó)女性發(fā)病率最高的腫瘤，也是威脅女性健康的首要疾病[1]，全球每年有超過40萬患者死于乳腺癌[2]。隨著個(gè)體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，特異性分子靶向治療成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human Runt-related transcription factor 3，RUNX3)屬于Runt家族成員，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。相關(guān)研究不斷發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子CpG島異常甲基化和胞漿內(nèi)錯(cuò)誤定位等均可導(dǎo)致RUNX3基因表達(dá)沉默和蛋白失活[3-4]，從而引發(fā)多種腫瘤,如胃癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、肝癌[7]和乳腺癌[8]等的發(fā)生。目前有研究認(rèn)為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性的乳腺癌中RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄阻遏，是RUNX3基因表達(dá)沉默的主要機(jī)制[9]。但是，RUNX3作為一種普遍存在的抑癌基因，在不同分子亞型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否存在胞漿錯(cuò)誤定位導(dǎo)致的失活還有待進(jìn)一步的研究。

本研究采用Western blot法和免疫熒光法檢測(cè)不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞中RUNX3的蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況,以及經(jīng)出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑來普霉素B(Leptomycin B)處理后RUNX3蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位的改變情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同亞型乳腺癌細(xì)胞系中均存在RUNX3在胞質(zhì)中錯(cuò)誤定位的現(xiàn)象，通過出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑逆轉(zhuǎn)RUNX3的胞質(zhì)定位能夠抑制腫瘤細(xì)胞的活力，提示抑制RUNX3的出核過程可能成為治療乳腺癌的一個(gè)新的方向，并為RUNX3成為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、SKBR-3、MDA-MB-231和BT-549及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所。DMEM培養(yǎng)基和L-15培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Leptomycin B、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；抗RUNX3抗體(R3-5G4)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自AbSci；EdU染色試劑盒購(gòu)自南京賽泓瑞生物公司；抗GAPDH抗體和抗Histone H3抗體購(gòu)自Affinity。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D和SKBR-3在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在含10% 胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乳腺癌細(xì)胞BT-549在含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A在含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，隔日換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合進(jìn)行傳代。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞傳代培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組和Leptomycin B處理組,將溶劑(PBS)和Leptomycin B(25 nmol/L)分別加入培養(yǎng)基中，孵育24 h。然后吸去培養(yǎng)基，提取總蛋白,按試劑盒方法分離胞漿和胞核蛋白,并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)常規(guī)方法，使用SDS-PAGE對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入 I 抗后4 ℃過夜孵育，抗體稀釋比為RUNX3(1∶4 500)、GAPDH(1∶4 000)和Histone H3(1∶3 000)。次日使用TBST洗滌緩沖液洗滌3遍后，加入II抗室溫孵育1 h，再洗滌3遍后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶，并采用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取單層生長(zhǎng)的細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，使細(xì)胞貼壁。更換新鮮培養(yǎng)基后，將細(xì)胞分為溶劑對(duì)照(control)組和Leptomycin B處理組。將溶劑(PBS)和Leptomycin B(25 nmol/L)分別加入培養(yǎng)基中，孵育24 h。然后取出蓋玻片，PBS洗2次。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加0.1% Triton X-100(細(xì)胞破膜)15 min，PBS洗3次,每次5 min。用10%正常羊血清封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行室溫封閉1 h。棄去封閉液勿洗，滴加 I 抗4 ℃過夜。PBS漂洗3次,每次5 min，滴加熒光 II 抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min，使用DAPI染核,室溫孵育5 min。PBS漂洗3次，每次5 min。滴加封片劑 1 滴，封片，熒光顯微鏡觀察隨機(jī)取6個(gè)視野拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.0×106/L,按每孔100 μL接種至96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜使細(xì)胞貼壁。去除上層培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為溶劑對(duì)照(control)組和Leptomycin B(25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L和100 nmol/L)處理組，按分組分別處理后，繼續(xù)培養(yǎng)于0 h、24 h、48 h和72 h， 取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，將完全培養(yǎng)基和CCK-8溶液按10∶1的比例預(yù)先混勻，每孔加入100 μL混合液，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，無細(xì)胞生長(zhǎng)孔，只加100 μL混合液，在37 ℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5EdU染色實(shí)驗(yàn) 按方法2.3細(xì)胞培養(yǎng)和處理方法培養(yǎng)細(xì)胞，配制含50 μmol/L EdU培養(yǎng)基。棄去細(xì)胞上清，使用含EdU的培養(yǎng)基孵育2 h，孵育完畢后棄去培養(yǎng)基，并使用PBS漂洗2次，每次5 min,然后每孔加入50 μL 4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min，棄去固定液，每孔加入50 μL甘氨酸(2 g/L)洗滌5 min。PBS洗滌5 min。每孔加入100 μL 0.5% Triton X-100 透化10 min，PBS洗滌5 min。每孔加入100 μL Apollo染色反應(yīng)工作液，避光孵育30 min;棄去上清，再次使用100 μL 0.5% Triton X-100 透化10 min,加入10 mg/L DAPI進(jìn)行核染色，室溫孵育5 min。PBS漂洗2次,每次5 min，最后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RUNX3在5種乳腺癌細(xì)胞系及正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)首先觀察5種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、SKBR-3、MDA-MB-231和BT-549中RUNX3)蛋白表達(dá)及定位情況，并分析不同分子亞型乳腺癌之間的關(guān)系，其中，MCF-7和T47D為ER陽性細(xì)胞系，SKBR-3為人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)陽性細(xì)胞系,MDA-MB-231和BT-549為三陰性細(xì)胞系，并選擇正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A作為對(duì)照。Western blot法對(duì)RUNX3在胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的結(jié)果可見，在不同亞型的乳腺癌細(xì)胞系中均能檢測(cè)到RUNX3的表達(dá)，見圖1A，推測(cè)在乳腺癌細(xì)胞中可能存在其它RUNX3失活機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，5種乳腺癌細(xì)胞胞漿中的RUNX3表達(dá)量明顯增多(P<0.05)，提示抑癌基因RUNX3的胞漿移位表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān),見圖1B。

Figure 1. The protein expression of RUNX3 in 5 breast cancer cell lines and normal breast epithelial cell. A: Western blot was used to detect the total expression of RUNX3; B: Western blot was used to detect the expression of RUNX3 in the cytoplasm and in nuclei. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMCF-10A group.

圖1RUNX3在5種乳腺癌細(xì)胞系及正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況

2 RUNX3的亞細(xì)胞定位

使用免疫熒光法對(duì)RUNX3的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，與Western blot結(jié)果一致，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，5種乳腺癌細(xì)胞中RUNX3蛋白存在明顯的胞漿移位，提示在不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞系中的RUNX3難以發(fā)揮抑癌活性的原因可能是其在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的錯(cuò)誤定位,見圖2。

Figure 2. The subcellular localization of RUNX3. Immunofluorescence was performed to analyze the subcellular localization of RUNX3 protein (red is RUNX3, blue is DAPI) in normal breast epithelial cell MCF-10A and 5 breast cancer cell lines MCF-7, T47D, SKBR-3, MDA-MB-231, BT-549. The scale bar=50 μm.

圖2免疫熒光法檢測(cè)RUNX3的亞細(xì)胞定位

3 Leptomycin B使腫瘤細(xì)胞活力明顯減弱并且使RUNX3重新定位于胞核

使用出核抑制劑Leptomycin B(25 nmol/L)對(duì)5種乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行處理，研究RUNX3的胞漿移位與其抑癌作用缺失間的關(guān)系。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明，Leptomycin B處理后，5種乳腺癌細(xì)胞的活力明顯減弱(P<0.05),見圖3A;EdU染色法證實(shí)，5種乳腺癌細(xì)胞經(jīng)Leptomycin B處理后，其增殖能力被顯著抑制,見圖3B。通過免疫熒光法進(jìn)一步確認(rèn)RUNX3的亞細(xì)胞定位改變情況，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)LeptomycinB處理后，5種乳腺癌細(xì)胞中的RUNX3均重新定位于胞核，見圖4；Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理組相比，Leptomycin B處理后，5種乳腺癌細(xì)胞胞漿中的RUNX3蛋白表達(dá)量明顯降低、胞核中的RUNX3蛋白表達(dá)量明顯增多(P<0.05),見圖5。結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示逆轉(zhuǎn)RUNX3出核行為能夠有效抑制不同亞型乳腺癌細(xì)胞的活力，針對(duì)性抑制RUNX3的胞漿錯(cuò)誤定位可能成為治療乳腺癌的新方向。

討 論

根據(jù)分子分型，乳腺癌可分成腺腔A型、腺腔B型、HER-2過表達(dá)型、基底樣型和正常乳腺樣型5個(gè)亞型，其中前2種為ER陽性表型，后2種為三陰性(雌激素受體、孕激素受體和HER-2表達(dá)均為陰性)表型。ER陽性表型乳腺癌臨床多以內(nèi)分泌治療為主，HER-2過表達(dá)型乳腺癌則以赫塞汀靶向治療為主，而三陰性表型乳腺癌因其明顯的異質(zhì)性及無特效的靶向治療藥物成為當(dāng)下的研究焦點(diǎn)。因此，進(jìn)一步了解在不同分子亞型乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的基因調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而開發(fā)特異性治療靶點(diǎn)是目前乳腺癌研究中尤為重要的內(nèi)容。

抑癌基因RUNX3是來自RUNT結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，該家族成員由RUNX1、RUNX2和RUNX3組成，其中RUNX1和RUNX2主要參與血細(xì)胞的生成和骨的生成，而RUNX3主要影響胃腸道和神經(jīng)的發(fā)生以及胸腺產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞等，三者均可作為腫瘤抑制因子[10]。RUNX3基因位于人染色體的1p36.1，編碼RUNX3蛋白。人類RUNX3蛋白是α、β 2個(gè)亞單位構(gòu)成的異二聚體，α亞單位含有一個(gè) RD(Runt domain)保守域，位于RUNX3蛋白的氨基酸末端，由128個(gè)氨基酸組成，介導(dǎo)RUNX3蛋白與DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用[11]。核蛋白R(shí)UNX3抑癌作用的實(shí)現(xiàn)與多種信號(hào)通路有關(guān)。已有文獻(xiàn)證實(shí)RUNX3蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)信號(hào)通路下游的1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，RUNX蛋白與Smad2和Smad3形成復(fù)合物傳遞TGF-β/activin信號(hào)進(jìn)而激活p21啟動(dòng)子,使p21基因表達(dá)明顯升高，最終抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[12-13]。Lin等[14]在胃癌中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的RUNX3可以降低Akt1的活性進(jìn)而使FoxO3a的磷酸化減少、活性增加，F(xiàn)oxO3a誘導(dǎo)的Bim基因表達(dá)增多，最終發(fā)揮抑癌作用。

Figure 3. The changes in the viability (A) and proliferation (B) of breast cancer cell lines after treatment with Leptomycin B (LMB). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLMB(-) group.

圖3CCK-8法和EdU染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LeptomycinB處理后細(xì)胞活力和增殖能力的變化

Figure 4. The subcellular localization of RUNX3 after Leptomycin B treatment. Immunofluorescence was used to detect the subcellular localization of RUNX3 in 5 breast cancer cell lines MCF-7, T47D, SKBR-3, MDA-MB-231 and BT-549 exposed in Leptomycin B at 25 nmol/L for 24 h. The cytoplasmic RUNX3 was significantly reduced and the nuclear RUNX3 was significantly increased. The scale bar=50 μm.

圖4免疫熒光法檢測(cè)LeptomycinB處理后RUNX3亞細(xì)胞定位的變化

Figure 5. The expression of RUNX3 in 5 breast cancer cell lines after treated with Leptomycin B (LBM). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLMB(-) group.

圖5Westernblot法檢測(cè)LeptomycinB處理后RUNX3蛋白表達(dá)量的變化

RUNX3蛋白在正常乳腺導(dǎo)管及組織內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞呈胞核陽性，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈胞質(zhì)陽性或者胞質(zhì)和胞核陽性[15]。而啟動(dòng)子CpG島異常甲基化和/或胞漿內(nèi)定位等均可以導(dǎo)致RUNX3基因表達(dá)沉默和蛋白失活，并且RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG 島異常甲基化是ER陽性乳腺癌中RUNX3表達(dá)沉默的主要機(jī)制。因此，我們推測(cè)在不同分子亞型乳腺癌中可能還存在著其它引起RUNX3失活的機(jī)制如胞漿移位失活等。

首先，我們探討了不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞中RUNX3的蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況。我們采用Western blot法檢測(cè)RUNX3在不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)5種乳腺癌細(xì)胞胞漿中的RUNX3表達(dá)量明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞；免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，即5種乳腺癌細(xì)胞胞漿中RUNX3的表達(dá)較正常乳腺上皮明顯增多。這些結(jié)果提示，在不同分子亞型乳腺癌中可能均存在著RUNX3的胞漿移位。

為進(jìn)一步驗(yàn)證RUNX3的胞漿移位與其抑癌作用的缺失有關(guān)，我們使用了出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑——Leptomycin B。Leptomycin B是一種鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以直接和染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白(chromosome region maintenance 1，CRM1)結(jié)合，從而抑制CRM1和帶有出核信號(hào)的蛋白結(jié)合，最終導(dǎo)致由CRM1介導(dǎo)的出核轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制[16]。CRM1是一種參與核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白[17]，已有文獻(xiàn)證實(shí)了RUNX3蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿的機(jī)制主要是通過CRM1介導(dǎo)的核輸出[18]。因此，我們將5種乳腺癌細(xì)胞用混有不同濃度的Leptomycin B的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間，CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示Leptomycin B工作濃度為25 nmol/L即可見明顯的效果，最佳作用時(shí)間可為24 h和48 h。故而，我們決定將5種乳腺癌細(xì)胞經(jīng)Leptomycin B(25 nmol/L，24 h)處理后，通過Western blot法及免疫熒光法檢測(cè)RUNX3蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞定位的改變情況。2種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果均顯示RUNX3細(xì)胞漿中表達(dá)量明顯減少、細(xì)胞核中表達(dá)量明顯增加，同時(shí)CCK-8檢測(cè)結(jié)果也顯示了5種癌細(xì)胞的活力明顯減弱，EdU染色實(shí)驗(yàn)證明Leptomycin B處理后細(xì)胞增殖能力顯著下降。

綜上所述，在不同分子亞型乳腺癌中均存在著不同程度的RUNX3蛋白的胞漿移位失活，有效逆轉(zhuǎn)RUNX3的核轉(zhuǎn)位能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，該機(jī)制可能成為治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。