孫 浩，者小書，張文奇，郝 斐，李文楠，劉 潔，劉東軍

(內(nèi)蒙古大學 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特 010070)

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是成體干細胞的一種，因其具有自我更新速度快、能夠穩(wěn)定增殖、具備多項分化潛能的特點，在體細胞核移植中可作為理想的供體細胞，并可作為臨床上較為理想的干細胞治療的細胞來源，因此有關(guān)其維持細胞干性功能的研究有非常重要的意義。體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)又稱體細胞克隆，指利用顯微操作技術(shù)培育出基因型與供體體細胞相同的克隆動物。但是，目前SCNT技術(shù)在實際應(yīng)用中仍然存在一些障礙，主要表現(xiàn)為幾乎所有物種的克隆效率較低、克隆胚胎發(fā)育異常，以及克隆動物出生后出現(xiàn)免疫缺陷甚至早期死亡等現(xiàn)象。其中SCNT胚胎的不完全重編程是導(dǎo)致克隆效率低的一個重要原因，而表觀遺傳修飾在其中有著決定性作用。

表觀遺傳機制指在不改變DNA序列的情況下，使基因發(fā)生遺傳性變化并最終影響細胞表型的機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控等，其中組蛋白修飾發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，包括乙?；⒓谆?、磷酸化和泛素化等，不正常的表觀遺傳修飾會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常甚至胚胎死亡，研究指出供體細胞基因組的組蛋白H3K9甲基化修飾的改變是影響SCNT重編程的主要因素。近年來，小分子抑制劑被普遍用于改善SCNT胚胎的表觀遺傳重編程。小分子抑制劑毛殼素是組蛋白 H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶39H1/2 和9A的特異性化學抑制劑，它會競爭性結(jié)合39H1/2，與某些關(guān)鍵殘基發(fā)生反應(yīng)，下調(diào)H3K9 me2和H3K9 me3的表達，以此增強表觀遺傳重編程和自噬活性來提高核移植胚胎的克隆效率。在人和哺乳動物中，、4 和2 被認為是調(diào)控干細胞多能性的3個重要的轉(zhuǎn)錄因子，并且已經(jīng)被證實在胚胎發(fā)生過程中具有重要的調(diào)控作用。但是,目前對這幾個基因的研究主要集中在維持干細胞干性和胚胎發(fā)育中的作用，而對其在體細胞核移植和表觀遺傳重編程過程中的研究鮮有報道。

本研究采用不同濃度的毛殼素處理gADSCs并檢測對其生長活性的影響，篩選最適處理濃度和時間；通過檢測適宜濃度毛殼素處理gADSCs后H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修飾相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄表達水平，并檢測H3K9 me2、H3K9 me3蛋白水平的變化，以研究毛殼素對細胞甲基化修飾的影響；通過檢測藥物處理gADSCs后胚胎多潛能相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，觀察表觀遺傳修飾對胚胎發(fā)育多潛能性的影響。試驗結(jié)果為研究組蛋白甲基化在山羊體細胞核移植過程中的分子機制及其對胚胎發(fā)育的影響提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細胞 本試驗所用的gADSCs采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂托克旗阿爾巴斯絨山羊，為本實驗室保存，且將其體外傳代至第5代進行試驗。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F-12、PBS、標準胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自BI公司；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Master Mix、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；組蛋白提取試劑盒購自Epigentek公司；Tween-20、5×蛋白上樣緩沖液、甲醇、12%SDS溶液、蛋白Marker、ECL顯色液、PVDF膜、BCA蛋白定量檢測試劑盒、TBS、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液均購自康為世紀公司；明膠購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物有限公司；一抗H3K9 me2、H3K9 me3購自景杰生物公司；二抗購自美國Proteintech公司；毛殼素購自上海Selleck公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 gADSCs細胞培養(yǎng)及藥物處理 將連續(xù)培養(yǎng)的第5代gADSCs接種于含20% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO和適宜濕度環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞匯度達到60%左右，分別添加濃度為0、20、30和50 nmol·L的毛殼素處理24 和48 h。

1.2.2 實時定量熒光PCR 收集不同濃度及不同時間毛殼素處理的細胞，用RNAiso Plus裂解液進行裂解，提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后進行實時熒光定量PCR，對目的基因的mRNA水平表達變化情況進行檢測。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置20 μL反應(yīng)體系：10 μL的SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL的PCR Forward Primer，0.4 μL的PCR Reverse Primer，2 μL的RT reaction solution，7.2 μL的RNase Free dHO；反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 40個循環(huán)，對每個樣品進行3次重復(fù)。作內(nèi)參對其進行標準化, 運用2方法計算目的基因的相對表達量。引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

A. 毛殼素處理gADSCs 24 h；B. 毛殼素處理gADSCs 48 h。*.P<0.05;**. P<0.01，下同A. gADSCs treated with chaetocin for 24 h; B. gADSCs treated with chaetocin for 48 h. *.P<0.05;**. P<0.01, the same as below圖1 不同濃度毛殼素處理gADSCs 24和48 h的細胞活性Fig.1 Cell viability of gADSCs treated with different concentrations of chaetocin for 24 and 48 h

A. 毛殼素處理gADSCs 24 h；B. 毛殼素處理gADSCs 48 hA. gADSCs treated with chaetocin for 24 h; B. gADSCs treated with chaetocin for 48 h圖2 實時定量PCR檢測不同濃度及時間毛殼素處理下G9A基因在gADSCs中的表達Fig.2 Real-time quantitative PCR to detect the expression of G9A gene in gADSCs under different concentrations and time of chaetocin treatment

1.2.3 藥物處理細胞活性檢測 利用CCK-8法檢測不同濃度梯度及時間梯度毛殼素處理的gADSCs 的活性，試劑使用方法及活力計算按說明書進行。即在96孔板中接種不同濃度毛殼素處理的細胞懸液(每孔100 μL)，在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)相應(yīng)的時間后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，用酶標儀測量450 nm處吸光度值。

1.2.4 組蛋白的提取 取對數(shù)生長期的gADSCs細胞接種于培養(yǎng)皿中，細胞貼壁后，用毛殼素處理細胞，收集細胞于無酶管中，加入1 mL 1×預(yù)裂解液，吹打20～50次。10 000 r·min，4 ℃離心1 min，移去上清。用裂解液重懸浮細胞，在冰上孵育30 min。12 000 r·min， 4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新管。每毫升上清加入0.3 mL Balance-DTT buffer。測定量蛋白后于-20 ℃保存(-80 ℃長久保存)，避免反復(fù)凍融。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測 根據(jù)所需依次配制相應(yīng)大小的分離膠和濃縮膠，向?qū)?yīng)的膠孔中加入5 μL蛋白Marker和20 ng待測蛋白樣品(根據(jù)之前測得的蛋白濃度確定體積)，然后依次以90 V/30 min，120 V/90 min的條件進行電泳。電泳后，根據(jù)目的條帶大小，切掉多余的膠，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后用TBST脫洗10 min，再用5%的脫脂奶粉封閉1 h。然后進行一抗、二抗孵育。孵育完成后，經(jīng)ECL發(fā)光顯色，用全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光，對待測蛋白表達量的變化進行分析。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測 細胞藥物處理前1 d將細胞爬片至小圓片上，待細胞融合至60%時，加藥處理，然后用PBS清洗3次后加入4%多聚甲醛室溫固定20 min。PBS清洗3次，加入0.1% Triton X-100冰上孵育15 min。PBS清洗3次后加入含有5% BSA的PBS封閉1 h。PBS清洗3次后用含有5% BSA的PBS按1∶300稀釋H3K9 me3、H3K9 me2抗體后在4 ℃過夜孵育。PBS清洗3次,避光加入PBS按1∶500配制的FITC熒光標記二抗,在室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，加入DAPI熒光染核,在室溫孵育10 min。PBS清洗3次 后封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究采用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行獨立樣本檢驗分析，<0.05為差異顯著，>0.05為差異不顯著，<0.01為差異極顯著，每組試驗獨立重復(fù)3次。圖片使用Image J進行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 毛殼素處理gADSCs最適濃度及時間的篩選

為了選取出在對細胞活性影響最低的情況下且最大程度抑制gADSCs甲基化的毛殼素處理濃度及處理時間，本試驗設(shè)置濃度梯度為0、20、30、50 nmol·L的毛殼素對gADSCs分別進行24和48 h的藥物處理，采用CCK-8法檢測不同處理組細胞的細胞活性，設(shè)定沒有藥物處理的細胞活性為100%。結(jié)果顯示(圖1)，20、30、50 nmol·L毛殼素處理gADSCs 24 h的細胞活性分別為85%、82%、66%，處理48 h的細胞活性分別為78%、55%、45%。實時定量PCR檢測不同濃度和處理時間的毛殼素處理gADSCs的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶9A的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示(圖2)，20、30、50 nmol·L毛殼素處理gADSCs 24 h時，9A的表達升高，分別為對照組的1.05倍、1.10倍、1.08倍；處理gADSCs 48 h時，9A的表達極顯著降低，分別為對照組的0.52倍、0.67倍、0.66倍(P<0.01)。綜上結(jié)果，20 nmol·L毛殼素處理gADSCs 48 h為最適處理條件。

2.2 毛殼素處理gADSCs對組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的影響

2.2.1 毛殼素處理gADSCs對組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)酶的影響 通過qRT-PCR檢測毛殼素處理gADSCs對組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)酶的mRNA水平的影響。結(jié)果顯示(圖3)，處理組的H3K9 me2甲基化轉(zhuǎn)移酶1、2和H3K9 me3甲基化轉(zhuǎn)移酶39H1、39H2與未處理組相比顯著降低，分別是對照組的0.59、0.65、0.34、0.36倍；H3K9 me2去甲基化酶3A、3B和H3K9 me3去甲基化酶4B、4D與未處理組相比表達量顯著增高，分別是對照組的1.13、1.34、1.45、1.36倍。綜上結(jié)果顯示，適宜濃度毛殼素處理gADSCs后H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)甲基化酶表達顯著降低，去甲基化酶表達顯著升高。

圖3 H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)酶表達的實時定量PCR檢測Fig.3 The real-time quantitative PCR detection of expression of H3K9 me2 and H3K9 me3 related enzymes

2.2.2 毛殼素處理gADSCs對H3K9 me2和H3K9 me3蛋白表達水平的影響 采用細胞免疫熒光技術(shù)檢測了未處理組與處理組的gADSCs中H3K9 me2和H3K9 me3的表達情況(圖4～6)。結(jié)果顯示，藥物處理組細胞H3K9 me2和H3K9 me3免疫熒光強度均低于0 nmol·L對照組，但是影響不顯著。提取毛殼素處理組的gADSCs的組蛋白，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的蛋白表達量，與未處理組進行對比分析(圖7)。結(jié)果顯示，與未處理組相比，處理組的gADSCs中H3K9 me2水平無明顯變化(>0.05)，而H3K9 me3水平顯著性降低(<0.05)。

圖4 毛殼素處理組和對照組細胞中組蛋白H3K9 me2的熒光強度比較Fig.4 Comparison of the fluorescence intensity of histone H3K9 me2 in gADSCs of the chaetocin-treated group and the control group

圖5 毛殼素處理組和對照組細胞中組蛋白H3K9 me3的熒光強度比較Fig.5 Comparison of the fluorescence intensity of histone H3K9 me3 in gADSCs of the chaetocin-treated group and the control group

圖6 H3K9 me2和H3K9 me3在絨山羊gADSCs中的熒光強度統(tǒng)計Fig.6 Fluorescence intensity statistics of H3K9 me2 and H3K9 me3 in gADSCs

圖7 毛殼素處理對gADSCs組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3表達的影響Fig.7 Effects of chaetocin treatment on the expression of histones H3K9 me2 and H3K9 me3 in gADSCs

2.3 毛殼素處理對脂肪間充脂干細胞多潛能性基因表達的影響

通過qRT-PCR檢測毛殼素對gADSCs多潛能性基因2、4、的相對轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示(圖8)，處理組細胞多潛能性基因的表達有不同程度的上調(diào)。其中4表達升高，是對照組的1.26倍；而表達量顯著增高，是對照組的1.75倍(<0.05)；2表達量極顯著增高，是對照組的6.91倍(<0.01)。

圖8 SOX2、OCT4、NANOG基因在gADSCs中的表達變化Fig.8 Expression changes of SOX2, OCT4, NANOG genes in gADSCs

3 討 論

gADSCs是體細胞克隆技術(shù)中優(yōu)良的核供體細胞，利用相關(guān)藥物調(diào)控表觀遺傳修飾可以促進表觀遺傳重編程，有利于SCNT胚胎的發(fā)育。本研究通過利用組蛋白 H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶特異性化學抑制劑毛殼素處理gADSCs，觀察gADSCs組蛋白甲基化修飾水平以及多潛能基因表達的改變，以便為提高絨山羊體細胞核移植的效率提供試驗依據(jù)。

在研究毛殼素對豬成纖維細胞的影響中發(fā)現(xiàn)，20 nmol·L毛殼素處理24 h，對細胞生長活性影響最小，并且對甲基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生抑制作用，隨著處理濃度的增加，毛殼素對甲基轉(zhuǎn)移酶基因的抑制作用增強，但高濃度的毛殼素會引起細胞的大量死亡。本試驗結(jié)果證明，當藥物處理濃度達50 nmol·L時，細胞生長活性明顯降低，且20 nmol·L毛殼素處理gADSCs 48 h時對細胞活性影響較小，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶9A的表達顯著降低，為最適處理濃度和時間。毛殼素處理豬SCNT胚胎后，H3K9 me3蛋白表達水平顯著降低，甲基轉(zhuǎn)移酶39H1和39H2的轉(zhuǎn)錄表達水平也顯著降低，H3K9 me3在SCNT胚胎中的異常表達是表觀遺傳重編程和合子基因組激活(ZGA)的主要表觀遺傳障礙，導(dǎo)致小鼠和人類胚胎發(fā)育失敗。本試驗通過實時定量熒光PCR檢測毛殼素處理gADSCs后H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)酶的表達，發(fā)現(xiàn)不僅H3K9 me3甲基化轉(zhuǎn)移酶9A、39H1、39H2表達水平降低，而且去甲基化轉(zhuǎn)移酶4B、4D表達水平顯著升高，結(jié)果表明毛殼素對gADSCs組蛋白甲基化水平的降低作用可能是下調(diào)相關(guān)的甲基化轉(zhuǎn)移酶表達以及上調(diào)特異性的去甲基化酶表達的協(xié)同機制下實現(xiàn)的。H3K9 me2是H3K9 me3形成所必需的，但H3K9 me3的降低是否與H3K9 me2e有關(guān)還不清楚，所以為了進一步探究毛殼素處理后對細胞內(nèi)H3K9 me2的影響，繼續(xù)檢測了H3K9 me2相關(guān)的甲基化轉(zhuǎn)移酶1、2以及去甲基化轉(zhuǎn)移酶3A、3B表達。結(jié)果表明，H3K9 me2相關(guān)的甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達與對照組相比均顯著降低，去甲基化酶的表達顯著升高。試驗結(jié)果說明，毛殼素處理細胞后不僅能降低H3K9 me3相關(guān)甲基化酶的表達水平，還能影響H3K9 me3形成過程中H3K9 me2相關(guān)甲基化酶和去甲基化酶轉(zhuǎn)錄水平的表達，所以毛殼素對組蛋白甲基化相關(guān)酶表達的改變不僅僅單一作用在一種甲基化水平上，也可能對其形成過程中單甲基化、二甲基化、三甲基化都產(chǎn)生影響，共同調(diào)控組蛋白甲基化水平的改變。之后又對gADSCs中H3K9 me2和H3K9 me3的蛋白水平進行了研究，結(jié)果表明H3K9 me3的表達明顯降低，但H3K9 me2表達沒有明顯變化，所以推測可能毛殼素處理細胞后只影響了H3K9 me2轉(zhuǎn)化為H3K9 me3后的蛋白水平的表達，也可能因為表觀遺傳修飾是動態(tài)平衡的，轉(zhuǎn)錄水平基因的表達改變后又因其他位點的甲基化修飾或是其他修飾的協(xié)同作用造成甲基化水平的恢復(fù)，具體影響蛋白水平的機制有待深入研究。

高水平的H3K9 me3主要抑制SCNT胚胎的發(fā)育，而2、4、又是維持胚胎干細胞多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，但是目前對于表觀遺傳修飾對多能性基因影響的研究較少，所以本研究又對處理組進行了2、4、基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測，試驗結(jié)果表明毛殼素處理gADSCs不僅可以降低細胞組蛋白甲基化水平，而且能提高胚胎干細胞多潛能相關(guān)基因的表達，其中處理組2的表達極顯著升高，2 在早期胚胎的生殖細胞、內(nèi)細胞團、多能干細胞以及癌細胞中均可表達，它不僅能夠調(diào)控組織細胞的增殖、決定細胞分化方向，還可以維持干細胞的全能性，它的缺失會導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，所以推測，高甲基化對胚胎發(fā)育的抑制作用可能是影響了2的表達，從而抑制了核移植后重構(gòu)胚的生長發(fā)育。

綜合本研究結(jié)果證明，適當條件的毛殼素處理體細胞核移植供體細胞gADSCs，將有效降低組蛋白甲基化水平，改變表觀遺傳修飾作用，影響胚胎干細胞多潛能調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄表達水平，有望提高SCNT胚胎重編程的效率。

4 結(jié) 論

本研究以絨山羊ADSCs為試驗材料，結(jié)果顯示濃度為20 nmol·L的毛殼素處理細胞48 h可以顯著降低gADSCs組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3相關(guān)甲基化酶的表達，提高去甲基化相關(guān)酶的表達；毛殼素處理gADSCs對H3K9 me2蛋白水平影響不顯著，但有效降低H3K9 me3蛋白水平的表達。毛殼素處理細胞后，gADSCs細胞中維持胚胎干細胞多潛能性和成體細胞重編程的相關(guān)基因2的表達顯著升高，4、表達也相對增高。