曾金紅，徐青元，沙瑋萍，吳 爽，李 媛，辛九慶，王秀梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150069)

牛傳染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia, CBPP)，又稱牛肺疫，是由絲狀支原體絲狀亞種(subsp, Mmm)引起的牛的一種高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害動物健康，被世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health, OIE)列為必須報告的動物疫病。該病的急性型至亞急性型以嚴(yán)重的纖維素性支氣管肺炎和胸腔積液為特征，暴發(fā)性流行時發(fā)病率和死亡率極高；而慢性或隱性感染時，潛伏期范圍較大，短則1周，長則2～4周，更有甚者可達(dá)半年，且發(fā)病過程和病理變化很輕微或無臨床癥狀，容易被人們所忽視。該病在20世紀(jì)50—70年代給我國養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，隨后通過大面積免疫及采用檢疫、隔離、撲殺等綜合防控措施被成功消滅。

近些年，CBPP重新出現(xiàn)并且擴(kuò)散到已宣布消滅的地區(qū)，例如：大部分的撒哈拉地區(qū)、肯尼亞、坦桑尼亞、盧旺達(dá)及部分歐洲國家等，引發(fā)新一輪大規(guī)模的努力去控制或消滅該病的流行。我國雖然已成功消滅CBPP，但由于我國周邊國家CBPP的流行狀況不明以及活牛非法入境數(shù)目較大等原因，CBPP跨境傳入我國的風(fēng)險日益增加。CBPP一旦重新傳入，將對我國養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性的打擊。本實驗室作為國家牛傳染性胸膜肺炎參考實驗室，每年承擔(dān)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下達(dá)的在全國范圍內(nèi)開展CBPP流行病學(xué)監(jiān)測的任務(wù)，亟需建立一種敏感、特異的檢測方法為我國CBPP的早期診斷和有效防控提供技術(shù)支撐。

本實驗室前期對Mmm分離株Ben-1的不同傳代株進(jìn)行全基因組測序，比較了不同代次菌株的基因組差異，通過生物信息學(xué)分析以及文獻(xiàn)檢索，初步篩選到13個Mmm特異性膜蛋白。根據(jù)前期研究結(jié)果最終選定膜蛋白M0071用于本研究，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化其重組蛋白rM0071，作為免疫原用于單抗制備。通過有限稀釋法亞克隆和間接ELISA法測定，獲得一株抗Mmm的特異性單克隆抗體3C4A1(MAb 3C4A1)，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)其具有良好的特異性和反應(yīng)性，可作為CBPP病原免疫學(xué)診斷的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和實驗動物 Mmm分離株Ben-1、牧1及其模式株P(guān)G1菌種均由國家牛傳染性胸膜肺炎參考實驗室保存，并按照高級別生物安全實驗室從事高致病性動物病原微生物實驗活動批復(fù)的內(nèi)容開展相關(guān)試驗；山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、牛鼻支原體、無乳支原體、牛支原體、leachii支原體等菌種由本實驗室保存；牛A型巴氏桿菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所牛羊病創(chuàng)新團(tuán)隊姜志剛副研究員贈送；SP2/0細(xì)胞、胎牛肺細(xì)胞(embryonic bovine lung, EBL)由本實驗室保存；CBPP陽性牛血清、陰性牛血清由本實驗室保存；6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗材料 表達(dá)載體pET-32a(+)由本實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶H Ⅰ、Ⅰ購自NEB公司；T4 DNA Ligase購自寶生物工程有限公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α及BL21(DE3)購自Vazyme公司；質(zhì)粒小提試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；Ni-NTA純化樹脂GE公司；NC膜購自PALL公司；10 ku規(guī)格超濾管購自Merck公司；Protein G親和層析柱購自武漢匯研生物科技股份有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、HAT和HT、融合劑PEG、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、HRP 標(biāo)記兔抗牛IgG抗體、TMB底物顯色液均購自Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；SBA Clonotyping System-HRP抗體亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-M0071的構(gòu)建 Mmm 0071基因由北京華大基因科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化、合成，并亞克隆至pUC 57載體，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α保存。將其按照1∶100比例接種于5 mL新鮮LB(含終濃度為100 μg · mLAmp)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)8～10 h后再轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。pUC 57-M0071質(zhì)粒和pET-32a(+)空載體分別經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行膠回收，利用T4連接酶連接回收的pET-32a(+)片段和M0071基因片段，采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布于含Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)。挑取3～5個單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，將PCR陽性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送長春庫美生物科技有限公司測序鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-M0071。

1.2.2 rM0071蛋白的表達(dá)純化及Western blot鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-M0071轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌中，涂布于含Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)。挑取單克隆菌落接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1%的比例轉(zhuǎn)接于500 mL LB培養(yǎng)基中(Amp)，37 ℃，200 r · min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(即OD為0.4～0.6)，加入終濃度為0.1 mmol · L的IPTG于16 ℃， 120 r · min誘導(dǎo)12 h。離心收集菌體，PBS洗滌兩次，再用適量PBS重懸菌體沉淀進(jìn)行超聲破碎，4 ℃， 8 000 r · min離心30 min，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。選取可溶性的重組蛋白采用鎳柱親和層析法純化，將洗脫收集的目的蛋白用PBS反復(fù)超濾3～4次， 超濾管中剩余的最終液體即為純化得到的rM0071蛋白。將純化的rM0071蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白純度，并用BCA蛋白定量試劑盒測定rM0071蛋白濃度，小量分裝，然后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。對純化的rM0071蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，即rM0071蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%魚明膠于室溫條件下封閉2 h，PBST洗滌3次；分別以1∶100稀釋的CBPP陽性牛血清、陰性牛血清作為一抗，于4 ℃孵育16 h，PBST洗滌3次；以1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗牛IgG抗體作為二抗，于室溫條件下孵育1 h，PBST洗滌3次；最后經(jīng)ECL顯色法分析rM0071蛋白的免疫反應(yīng)性。

1.2.3 小鼠免疫 將純化后的rM0071蛋白按每只小鼠100 μg的劑量與弗氏佐劑1∶1混合并充分乳化，采用背部皮下多點注射法免疫6周齡小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐劑與rM0071混合，間隔2周后使用弗氏不完全佐劑與rM0071混合繼續(xù)免疫。第3次免疫后，用間接ELISA方法測定小鼠的血清抗體效價，當(dāng)小鼠血清效價達(dá)到1∶51 200以上時，選擇抗體滴度最高的小鼠，在融合前3～5 d用不加佐劑的抗原(每只小鼠100 μg)采用腹腔注射的方法加強(qiáng)免疫1次。

1.2.4 間接ELISA檢測方法的建立 采用方陣滴定法，用碳酸鹽緩沖液將純化的rM0071蛋白分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3 125 μg·mL濃度包被酶標(biāo)板，免疫小鼠血清(作為陽性血清)和未免疫小鼠血清(作為陰性血清)分別以1∶100、1∶200、 1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、 1∶12 800稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗作1∶8 000稀釋。其他步驟按常規(guī)ELISA反應(yīng)程序進(jìn)行，選取陽性血清OD值/陰性血清OD值> 2.1，且陽性血清OD值接近1.0時所對應(yīng)的抗原濃度、一抗稀釋度作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.2.5 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 融合前1 d，取空白小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞于HAT選擇培養(yǎng)基中，按照100 μL·孔將細(xì)胞懸液加入到96孔 培養(yǎng)板中培養(yǎng)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，于含 5% CO的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，取加強(qiáng)免疫小鼠的脾細(xì)胞與對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞在PEG促融劑作用下進(jìn)行融合，用HAT選擇培養(yǎng)基輕輕懸浮融合細(xì)胞，并以100 μL·孔將細(xì)胞懸液添加至飼養(yǎng)層細(xì)胞中培養(yǎng)。培養(yǎng)5～6 d后，用HT培養(yǎng)基進(jìn)行半換液。待細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變黃，每孔取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA方法進(jìn)行檢測。

以純化的rM0071蛋白為包被抗原，采用已建立的間接ELISA方法篩選分泌抗rM0071抗體的陽性克隆。采用有限稀釋法對抗體效價高、細(xì)胞團(tuán)單一的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行3～4次亞克隆，直至抗體分泌穩(wěn)定、陽性孔的比例>95%時，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存保種。

1.2.6 單克隆抗體腹水的制備及純化 取10～12周齡的雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射0.5 mL 弗氏不完全佐劑。致敏1周后，將處于對數(shù)生長期的1×10～1×10個雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔，同時設(shè)置SP2/0細(xì)胞作為陰性對照組。每天觀察小鼠腹部變化，待小鼠腹部明顯膨大后使用引流針采集腹水(多次采集直至小鼠死亡)，于8 000 r · min、 4 ℃離心30 min，收集中間的腹水層，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占母顾鬟m當(dāng)稀釋后使用Protein G柱子進(jìn)行純化，具體純化操作步驟參照匯研生物Protein G柱子純化使用說明書。將純化后的腹水抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用小型分光光度計測定純化抗體的濃度。

1.2.7 單克隆抗體性質(zhì)鑒定

1.2.7.1 單克隆抗體的特異性鑒定: 采用Western blot鑒定單克隆抗體的特異性。本試驗選取可引起反芻動物呼吸道疾病的其他病原，包括山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、牛鼻支原體、無乳支原體、牛支原體、Leachii支原體、牛A型巴氏桿菌、絲狀支原體絲狀亞種分離株(Ben-1和牧1)及其模式株P(guān)G1的全菌體蛋白，與純化的rM0071蛋白同時進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%魚明膠于室溫條件下封閉2 h， PBST洗滌3次；加入1∶ 500稀釋的單克隆抗體于4 ℃孵育16 h，PBST洗滌3次；以1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行反應(yīng)，于室溫條件下孵育1 h；PBST洗滌3次后，經(jīng)ECL顯色法觀察結(jié)果。Mmm分離株(Ben-1和牧1)及其標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1均在高級別生物安全實驗室培養(yǎng)和滅活后制備全菌體蛋白。

1.2.7.2 單克隆抗體亞類的鑒定: 采用SBA Clonotyping System-HRP抗體亞類鑒定試劑盒對MAb 3C4A1進(jìn)行亞類鑒定，具體操作方法參考說明書。

1.2.7.3 間接ELISA方法測定MAb抗體效價: 以常規(guī)的間接ELISA方法測定MAb抗體效價，將純化的單克隆抗體設(shè)置10個不同稀釋倍數(shù)(分別為1∶1 000、 1∶2 000、 1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、 1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000)，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)孔，以免疫小鼠血清作為陽性對照，SP2/0腹水作為陰性對照。稀釋樣品孔OD/陰性對照OD> 2.1時所對應(yīng)的最大單抗稀釋倍數(shù)，即為抗體效價。

1.2.8 間接免疫熒光(IFA)檢測 以制備的MAb 3C4A1作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗。用10CCU · mL的Ben-1、牧1、牛鼻支原體、無乳支原體、牛支原體等培養(yǎng)物1 mL，離心收集菌體沉淀，無菌PBS洗滌3次后，用12 mL DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸菌體沉淀。按照500 μL·孔將重懸的菌體純培養(yǎng)物接種于鋪有EBL細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時設(shè)置未感染細(xì)胞為空白對照，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)6 h。 PBS洗滌2次，洗去未黏附的菌體，用4%多聚甲醛于室溫條件下固定細(xì)胞30 min；PBST洗滌3次，加入5%魚明膠于室溫條件下封閉1 h；PBST洗滌3次，每孔加入1∶100稀釋的單克隆抗體(設(shè)置免疫小鼠血清作為陽性對照；未免疫小鼠血清作為陰性對照)，于室溫條件下孵育1 h；PBST洗滌3次，加入1∶800稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，于室溫下避光孵育1 h；PBST洗滌3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、分析并采集圖像。Ben-1和牧1感染EBL細(xì)胞及其IFA檢測均在高級別生物安全實驗室操作。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-M0071的構(gòu)建與鑒定

按照“1.2.1”中描述的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-M0071。使用內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，獲得約5 900 bp的載體片段和約1 500 bp的基因片段，與目的基因大小相符。

M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 重組質(zhì)粒pET-32a-M0071的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切產(chǎn)物M. DL5000 DNA marker; 1. Double digestion products of recombinant plasmid pET-32a-M0071 (BamH Ⅰ,Sal Ⅰ)圖1 重組質(zhì)粒pET-32a-M0071的雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion identification of recombinant plasmid pET-32a-M0071

基因測序結(jié)果表明，插入的基因序列與Ben-1株的M0071基因序列完全一致，表明pET-32a-M0071重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 rM0071蛋白的可溶性分析及純化鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-M0071轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖2所示，rM0071蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)，以可溶性表達(dá)為主，且在約73 ku位置出現(xiàn)目的條帶，與目的蛋白預(yù)期大小相符。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得了純度較高的rM0071目的蛋白，可用于后續(xù)研究。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-BL21空載體；2. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-M0071-BL21全菌；3. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-M0071-BL21全菌；4. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-M0071-BL21重組菌裂解上清；5. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-M0071-BL21重組菌裂解沉淀；6. 純化的rM0071蛋白M. Protein molecular weight marker; 1. pET-32a-BL21 empty carrier induced by IPTG; 2. pET-32a-M0071-BL21 whole bacteria without IPTG induction; 3. pET-32a-M0071-BL21 whole bacteria induced by IPTG; 4. IPTG induced pET-32a-M0071-BL21 recombinant bacteria lysate supernatant； 5. IPTG induced pET-32a-M0071-BL21 recombinant bacteria lysate precipitation; 6. Purified rM0071 protein圖2 重組蛋白M0071誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定Fig.2 Induced expression and purification of recombinant protein M0071

2.3 rM0071蛋白免疫反應(yīng)性鑒定

利用Western blot鑒定rM0071純化蛋白的免疫反應(yīng)性，結(jié)果如圖3所示，該融合蛋白與CBPP陽性牛血清可以發(fā)生特異性反應(yīng)，在約73 ku位置出現(xiàn)特異性條帶，而與CBPP陰性牛血清不發(fā)生特異性反應(yīng)。表明該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. CBPP陽性牛血清；2. CBPP陰性牛血清M. Protein molecular weight marker; 1. CBPP positive bovine sera; 2. CBPP negative bovine sera圖3 重組蛋白M0071免疫反應(yīng)性鑒定Fig.3 Immune reactivity detection of recombinant protein M0071

2.4 間接ELISA方法建立及陽性雜交瘤細(xì)胞株篩選

根據(jù)方陣滴定法結(jié)果，rM0071蛋白以2.5 μg · mL包被酶標(biāo)板，待檢血清作1∶3 200稀釋，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作1∶8 000稀釋，按照常規(guī)反應(yīng)程序進(jìn)行間接ELISA試驗。用已建立的間接ELISA方法對融合后8～10 d孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變黃的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測，在陰、陽性對照成立的條件下，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清OD值/陰性對照OD值> 2.1即判定其對應(yīng)細(xì)胞孔為陽性孔。將抗體效價高、細(xì)胞團(tuán)單一的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行3次亞克隆，最終獲得1株能穩(wěn)定分泌抗rM0071蛋白抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C4A1。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

Western blot試驗結(jié)果如圖4所示，MAb 3C4A1能與rM0071蛋白和Mmm分離株Ben-1、牧1及其標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、牛鼻支原體、無乳支原體、牛支原體、Leachii支原體和牛A型巴氏桿菌等發(fā)生反應(yīng)。說明制備的單抗具有很高的特異性，可用于鑒別Mmm與其他病原。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. rM0071蛋白；2. Mmm分離株Ben-1；3. Mmm分離株牧1；4. Mmm模式株P(guān)G1；5. 山羊支原體山羊肺炎亞種；6. 絲狀支原體山羊亞種；7. 牛鼻支原體；8. 無乳支原體；9. 牛支原體；10. Leachii支原體；11. 牛A型巴氏桿菌M. Protein molecular weight marker; 1. rM0071 protein; 2. Mmm isolate Ben-1; 3. Mmm isolate Mu 1; 4. Mmm type strain PG1; 5. Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp; 6. Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc; 7. Mycoplasma bovirhinis; 8. Mycoplasma agalactiae; 9. Mycoplasma bovis; 10. Mycoplasma leachii; 11. Bovine pasteurella type A圖4 單克隆抗體3C4A1特異性鑒定Fig.4 Specificity identification of monoclonal antibody 3C4A1

2.6 單克隆抗體亞類和純化鑒定

單克隆抗體經(jīng)亞類鑒定顯示MAb 3C4A1屬于IgG1亞類，輕鏈為κ鏈。對MAb 3C4A1腹水采用Protein G親和層析純化，如圖5所示，純化后的單克隆抗體可見一條大小約55 ku的重鏈和一條大小約25 ku的輕鏈，條帶大小正確且清晰，與IgG結(jié)構(gòu)一致，純化效果良好。采用間接ELISA方法測定MAb 3C4A1純化抗體的效價可達(dá)到1∶256 000，表明MAb 3C4A1具有較高的親和力。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 純化的3C4A1單克隆抗體M. Protein molecular weight marker; 1. Purified monoclonal antibody 3C4A1圖5 單克隆抗體3C4A1純化鑒定Fig.5 Purification of monoclonal antibody 3C4A1

2.7 IFA檢測EBL細(xì)胞Mmm感染情況

將已接種Ben-1、牧1、牛鼻支原體、無乳支原體和牛支原體的EBL細(xì)胞培養(yǎng)孔及陽性對照孔、陰性對照孔和空白對照孔，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖6所示，除接種Ben-1、牧1的細(xì)胞孔和陽性對照孔有明顯的綠色熒光外，牛鼻支原體、無乳支原體、牛支原體感染細(xì)胞孔和陰性對照孔、空白對照孔均未出現(xiàn)綠色熒光，說明MAb 3C4A1能夠特異性識別感染EBL細(xì)胞的Mmm，與其他支原體不發(fā)生交叉反應(yīng)。上述結(jié)果表明，該單抗是Mmm特異性單克隆抗體，可將其作為IFA檢測的一抗用于Mmm感染的診斷。

a. 陽性對照(免疫小鼠血清)；b. 陰性對照(未免疫小鼠血清)；c. 空白對照(未感染細(xì)胞)；d. 牛鼻支原體；e. 無乳支原體；f. 牛支原體；g. Mmm分離株Ben-1；h. Mmm分離株牧1a. Positive control (immunized mouse serum); b. Negative control (serum of nonimmunized mouse); c. Blank control(uninfected EBL cells); d. Mycoplasma bovirhinis; e. Mycoplasma agalactiae; f. Mycoplasma bovis; g. Mmm isolate Ben-1; h. Mmm isolate Mu 1圖6 單抗3C4A1用于IFA檢測感染EBL細(xì)胞的不同支原體Fig.6 IFA detection of different mycoplasma from infected EBL cells by using MAb 3C4A1

3 討 論

我國經(jīng)過幾十年的努力，于2011年5月被OIE認(rèn)證為無CBPP的國家。為保持我國無疫狀態(tài)，本實驗室每年對全國重點地區(qū)牛群進(jìn)行CBPP病原學(xué)監(jiān)測。目前，我國對CBPP的病原學(xué)診斷主要以病原分離培養(yǎng)和核酸檢測為主。其中，病原分離培養(yǎng)是鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但支原體營養(yǎng)要求苛刻、生長周期長，容易被其他細(xì)菌污染，分離鑒定困難，而且病原分離培養(yǎng)需獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批復(fù)方可在高級別生物安全實驗室內(nèi)開展，不能滿足CBPP早期快速診斷和風(fēng)險預(yù)警的需求。基于PCR方法的核酸檢測靈敏度高，但需要特殊的儀器設(shè)備，對試驗條件及操作人員要求較高，同時也需要對病料樣本進(jìn)行復(fù)雜的處理，不能滿足高通量檢測的需求。因此，亟需建立一種快速準(zhǔn)確的病原檢測方法以滿足CBPP早期精準(zhǔn)診斷和及時防控的需求。

根據(jù)OIE“陸生動物診斷和疫苗手冊”規(guī)定，CBPP可通過免疫熒光試驗和生長抑制試驗等免疫學(xué)試驗診斷，其病原培養(yǎng)物或感染的組織、器官組織液可使用IFA進(jìn)行確診，但需要使用抗Mmm的高免血清為一抗。IFA的特異性與所用的一抗密切相關(guān)，因Mmm與絲狀支原體家族的其他成員如山羊支原體山羊亞種、山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、Leachii親緣關(guān)系很近，Mmm不同菌株的多肽譜高度相似，而OIE推薦的抗Mmm的高免血清為多抗，使用時可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，甚至假陽性。而抗Mmm的特異單克隆抗體可以避免這種交叉反應(yīng)，能提高IFA的特異性和敏感性。特異性強(qiáng)的單克隆抗體已被證明可用于支原體物種鑒定，是建立快速準(zhǔn)確的病原及抗體檢測方法必不可少的工具。國外Brooks等和Rodriguez等已分別成功研制出針對Mmm的特異性單克隆抗體MAb 6E3和MAb 3H12，并基于這兩株單抗建立了雙抗體夾心ELISA方法用于Mmm病原的快速檢測和鑒定，顯示出良好的特異性和敏感性，取得了良好的效果。Le等也成功制備出Mmm特異的單克隆抗體MAb 117/5，基于該單抗的競爭ELISA方法，具有較高特異性和敏感性，是當(dāng)前OIE推薦的也是國際上適用的CBPP血清學(xué)檢測方法。由于我國為CBPP無疫國家，Mmm檢測技術(shù)的研究相對緩慢和滯后，目前我國尚無可用于CBPP病原診斷的特異性單克隆抗體。

鑒于此，本研究依據(jù)實驗室前期研究結(jié)果，選取能與CBPP陽性牛血清發(fā)生免疫反應(yīng)的rM0071蛋白制備單克隆抗體。經(jīng)篩選獲得1株針對rM0071蛋白的單克隆抗體MAb 3C4A1，Western blot試驗證明該抗體能與Mmm發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與其他病原發(fā)生反應(yīng)，與Brooks等制備的MAb 6E3顯示出相似的特異性，表明MAb 3C4A1具有針對Mmm的良好特異性。進(jìn)一步，將MAb 3C4A1作為一抗用于IFA試驗，分別檢測感染細(xì)胞中的Mmm、牛鼻支原體、無乳支原體和牛支原體，結(jié)果顯示MAb 3C4A1僅對Mmm感染的EBL細(xì)胞顯示特異性熒光反應(yīng)，與其他的支原體沒有交叉反應(yīng)，表明基于MAb 3C4A1的IFA檢測方法可用于Mmm感染的檢測。綜上所述，本研究制備的MAb 3C4A1是Mmm高度特異的單克隆抗體，可以作為CBPP病原免疫學(xué)診斷的工具抗體，為進(jìn)一步研制CBPP病原鑒別診斷試劑盒提供了基礎(chǔ)材料。

4 結(jié) 論

獲得1株抗絲狀支原體絲狀亞種(Mmm)的單克隆抗體MAb 3C4A1，該抗體只與Mmm發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而不與其他病原發(fā)生反應(yīng)；并能識別EBL細(xì)胞中的Mmm，可將其用于實驗室對CBPP病原的免疫學(xué)診斷。