顏 碩，趙珊珊，朱振東，潘慶杰，董煥聲

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109)

哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，分為3個(gè)階段：首先，原始生殖細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂；其次，精母細(xì)胞經(jīng)歷兩次連續(xù)的分裂過(guò)程產(chǎn)生單倍體精子細(xì)胞；最后，精子細(xì)胞的核、頂體、細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，最終逐漸發(fā)育成熟。附睪是位于睪丸表面的供精子成熟和儲(chǔ)存的長(zhǎng)曲小管，它包括3個(gè)獨(dú)立但密切聯(lián)系的部分：假?gòu)?fù)層柱狀上皮(主細(xì)胞、基細(xì)胞、亮細(xì)胞等)、腔內(nèi)環(huán)境和精子。腔內(nèi)環(huán)境通過(guò)直接分泌或囊泡運(yùn)輸介導(dǎo)上皮細(xì)胞和精子之間蛋白質(zhì)、小分子代謝物的轉(zhuǎn)移和交換。根據(jù)解剖學(xué)規(guī)定，附睪分為頭、體和尾部3個(gè)區(qū)域，頭部和體部是精子成熟的地方，尾部主要發(fā)揮存儲(chǔ)精子的作用。精子進(jìn)入附睪之前，雖然形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)已基本成熟，但不具備識(shí)別、結(jié)合卵細(xì)胞的能力。精子發(fā)生和成熟是精子和復(fù)雜的外部環(huán)境之間的相互作用所驅(qū)動(dòng)的，附睪對(duì)于睪丸后精子成熟極其重要。在相同且適宜的培養(yǎng)基中，附睪尾部精子可以進(jìn)行直線運(yùn)動(dòng)，而附睪頭部精子則表現(xiàn)出微弱擺動(dòng)，極少有直線運(yùn)動(dòng)的個(gè)體。未成熟精子會(huì)影響早期胚胎的發(fā)生，且降低卵母細(xì)胞受精率，有研究表明，使用附睪頭部精子受精的卵母細(xì)胞在后續(xù)發(fā)育中將產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，綿羊具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，了解綿羊附睪的結(jié)構(gòu)和功能，闡明精子在附睪頭、體和尾部遷移過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，對(duì)探索精子成熟機(jī)制和調(diào)節(jié)雄性生育能力具有指導(dǎo)意義。

生物信息學(xué)的發(fā)展為尋找精子成熟相關(guān)蛋白質(zhì)的種類及功能分析提供了條件。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成功應(yīng)用于人類、豬、水牛、貓和小鼠等不同物種的精子研究上。隨著液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在生物學(xué)領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，并產(chǎn)生了大量的原始數(shù)據(jù)和研究材料，為探索潛在機(jī)制和發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的潛在生物標(biāo)志物打開(kāi)了另一扇窗。大分子物質(zhì)穿過(guò)核膜的雙向運(yùn)輸是真核細(xì)胞的特點(diǎn)，核孔復(fù)合體(NPC)是細(xì)胞核膜上溝通核質(zhì)與胞質(zhì)的開(kāi)口，由內(nèi)外兩層膜的局部融合所形成，它能調(diào)節(jié)核質(zhì)運(yùn)輸，是參與轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞周期等過(guò)程的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。精子在附睪中不斷成熟的過(guò)程離不開(kāi)核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法找到相關(guān)的差異表達(dá)蛋白是闡明問(wèn)題的關(guān)鍵。

本研究采用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過(guò)肽TMT標(biāo)記、高pH反相色譜柱分級(jí)分離和LC-MS/MS分析，明晰綿羊附睪頭、體和尾部精子的差異與特點(diǎn)。鑒定出616個(gè)差異表達(dá)蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證精子成熟、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

從日照市屠宰場(chǎng)獲得性成熟(12月齡)雄性湖羊的附睪樣品，把附睪按解剖結(jié)構(gòu)分為頭、體和尾部3個(gè)區(qū)域，依次提取精子。聚丙烯酰胺凝膠、PVDF膜、胎牛血清、Hoechst 33342和Triton-X均購(gòu)自北京索萊寶公司；抗體均購(gòu)自武漢Abcolnol公司；蛋白質(zhì)組學(xué)部分所用試劑、儀器均由上海拜譜生物科技有限公司提供。

1.2 測(cè)序與質(zhì)控

9例綿羊精子細(xì)胞，3組樣本(頭、體、尾)，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。從每個(gè)樣品中取出100 μg肽，并使用高pH反相色譜柱(PierceHigh pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit, Thermo Fisher)對(duì)干燥的肽進(jìn)行處理。從每個(gè)樣品中取出適量的肽，并使用Easy nLC 1200色譜系統(tǒng)(Thermo Scientific)進(jìn)行色譜分離。將得到的LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入Proteome Discoverer 2.4軟件，用于對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)解釋和蛋白質(zhì)鑒定(https://www.uniprot.org)。初始搜索設(shè)置在10 ppm 的前體質(zhì)量窗口，修飾組如下：固定修飾：氨基甲酰甲基(C)、TMT10plex(K)、TMT10plex(N-term)；可變修飾：Oxidation(M)和Acetyl(Protein N-term)。使用質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

使用Microsoft Excel和R軟件對(duì)質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。差異表達(dá)蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold change>1.2或<0.83，<0.05。進(jìn)行GO、KEGG注釋和富集分析，以及針對(duì)多個(gè)測(cè)試的FDR校正。富集的GO和KEGG通路在<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡

檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)量：通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)上。5%胎牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育封閉2 h，一抗孵育PVDF膜過(guò)夜，4 ℃。HRP標(biāo)記的二抗孵育PVDF膜2 h，曝光，使用Image J進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子FITC水平。1)制備適當(dāng)濃度的精子細(xì)胞懸液，0.1% Triton-X工作液細(xì)胞膜穿孔30 min。2)5% BSA封閉30 min。3)一抗孵育90 min，37 ℃。4)FITC標(biāo)記的二抗孵育1 h，避光37 ℃。5)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品。

1.6 免疫熒光

免疫熒光定位蛋白質(zhì)表達(dá)部位：1)制備適當(dāng)濃度的精子細(xì)胞懸液，取10 μL精子懸液滴在載玻片上，室溫靜置10 min。2)4%多聚甲醛固定30 min。3) 0.1% Triton-X工作液細(xì)胞膜穿孔30 min。4)5% BSA封閉30 min。5)一抗孵育過(guò)夜，4 ℃。6)FITC標(biāo)記的二抗孵育1 h，37 ℃。7)Hoechst 33342用于核染色，5 min。8)成像系統(tǒng)(Carl Zeiss AG, German)拍照并進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 附睪頭、體和尾部精子的全蛋白結(jié)果

本研究使用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析綿羊附睪頭、體和尾部3個(gè)區(qū)域的精子之間蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。通過(guò)LC-MS/MS分析，從22 841個(gè)唯一性肽中鑒定到2 691種蛋白質(zhì)。GO注釋分析結(jié)果如下，生物過(guò)程結(jié)果表明，精子表達(dá)蛋白主要以細(xì)胞過(guò)程(cellular process，966)、代謝過(guò)程(metabolic process，677)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation，195)為主；分子功能結(jié)果表明，精子表達(dá)蛋白主要以結(jié)合(binding，1 105)、催化活性(catalytic activity，858)、結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity，114)、ATP酶(ATPase，110)為主；細(xì)胞組分結(jié)果表明，精子表達(dá)蛋白主要以細(xì)胞解剖實(shí)體(cellular anatomical entity，542)、含蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex，319)為主(圖1)。KEGG注釋通路主要為代謝途徑(metabolic pathways)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、產(chǎn)熱(thermogenesis)、碳代謝(carbon metabolism)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、亨延頓病(Huntington disease)和帕金森病(Parkinson disease)等(圖2)。

圖1 附睪頭、體和尾部精子的蛋白質(zhì)組GO分析Fig.1 GO analysis of sperm from caput, corpus and cauda in epididymis

圖2 附睪頭、體和尾部精子的蛋白質(zhì)組KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis bubble chart of sperm from caput, corpus and cauda in epididymis

2.2 附睪頭、體和尾部精子的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

經(jīng)-test檢驗(yàn)，在組間差異比較的閾值為<0.05和Fold change>1.2或<0.83時(shí)，鑒定出差異表達(dá)蛋白616個(gè)。其中，尾.頭組鑒定出309個(gè)差異表達(dá)蛋白(上調(diào)：213個(gè)，下調(diào)：96個(gè))；尾體組鑒定出167個(gè)差異表達(dá)蛋白(上調(diào)：107個(gè)，下調(diào)：60個(gè))；體頭組鑒定出140個(gè)差異表達(dá)蛋白(上調(diào)：88個(gè)，下調(diào)：52個(gè))。本研究鎖定入核載體蛋白組成亞基—KPNA4，作為候選蛋白并后續(xù)驗(yàn)證。KPNA4在尾頭組中差異表達(dá)倍數(shù)為1.95，在尾體組中差異表達(dá)倍數(shù)為1.45，均顯著。Venn圖如圖3所示。

圖3 尾 vs.頭、尾 vs. 體和體 vs. 頭3組差異表達(dá)蛋白質(zhì)的集合關(guān)系Fig.3 The collective relationship of the 3 groups (cauda vs. caput group, cauda vs. corpus group, corpus vs. caput group) of differentially expressed proteins

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果

對(duì)附睪頭、體和尾部精子進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)，精子在附睪移行過(guò)程中，KPNA4表達(dá)量呈上升趨勢(shì)(圖4)，精子樣本分組為：附睪頭部組(caput)、附睪體部組(corpus)和附睪尾部組(cauda)。

A. 蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果圖，KPNA4為58 ku；α-Tubulin為50 ku，內(nèi)參蛋白。B. 蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，使用Image J分析[20]A. Western blot, KPNA4 is 58 ku; α-Tubulin is 50 ku, internal reference protein. B. Analysis of relative expression levels using Image J [20]圖4 Western blot結(jié)果Fig.4 Western blot result

2.4 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

對(duì)附睪頭、體和尾部精子進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)，F(xiàn)ITC強(qiáng)度梯度增高，因此，KPNA4的表達(dá)量在3個(gè)區(qū)域的精子中呈上升趨勢(shì)(圖5)，精子樣本分組為：附睪頭部組(caput)、附睪體部組(corpus)和附睪尾部組(cauda)。

縱坐標(biāo)為精子數(shù)，橫坐標(biāo)為FITC強(qiáng)度。藍(lán)色虛線. 附睪頭部的精子；紅色虛線. 附睪體部的精子；綠色虛線.附睪尾部的精子；黑色實(shí)線.陰性對(duì)照The ordinate is the number of sperm, and the abscissa is the FITC intensity. Blue dotted line. Sperm in the caput of the epididymis; red dotted line. Sperm in the corpus of the epididymis; green dotted line. Sperm in the cauda of the epididymis; black solid line. Negative control圖5 KPNA4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果Fig.5 KPNA4 flow cytometry results

2.5 免疫熒光結(jié)果

KPNA4作為入核載體蛋白應(yīng)主要分布于核仁或細(xì)胞質(zhì)，免疫熒光結(jié)果與預(yù)測(cè)相吻合：顯示其定位于精子頭部，尾部少有表達(dá)。附睪頭、體和尾部3個(gè)區(qū)域的精子均定位于精子頭部(圖6)。精子樣本分組為：附睪頭部組(caput)、附睪體部組(corpus)和附睪尾部組(cauda)。KPNA4呈綠色，Hoechst 33342用于核染呈藍(lán)色，Merge為KPNA4-FITC和Hoechst融合圖。

KPNA4. 綠色熒光；Hoechst. 核染；Merge.KPNA4-FITC和Hoechst融合圖KPNA4. Green fluorescence; Hoechst. Nuclear staining; Merge. KPNA4 and Hoechst merge image圖6 免疫熒光結(jié)果Fig.6 Immunofluorescence results

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)生物系統(tǒng)中全部蛋白質(zhì)的研究，正在成為一門數(shù)據(jù)豐富的科學(xué)，蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中被全面編譯，這些不斷更新的數(shù)據(jù)庫(kù)除了提供各種生物的氨基酸序列和相關(guān)基因外，還為蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析、蛋白質(zhì)注釋、多重比對(duì)計(jì)算等提供了重要的信息。隨著串聯(lián)質(zhì)譜(MS)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)表達(dá)和翻譯后修飾(PTMs)可以在全球范圍內(nèi)的各種生物系統(tǒng)中進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾廣泛存在，從而改變其結(jié)構(gòu)和功能，因此數(shù)據(jù)信息不能簡(jiǎn)單地依靠基因組或轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果——蛋白質(zhì)組學(xué)是基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的補(bǔ)充與進(jìn)步。近年來(lái)，生物信息學(xué)飛速地發(fā)展，利用計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力解決了生物試驗(yàn)中出現(xiàn)的大量數(shù)據(jù)，并在其中發(fā)現(xiàn)了更多的生物規(guī)律和特征。有大量文獻(xiàn)證明精子在附睪中進(jìn)一步成熟，但詳細(xì)的機(jī)制、基因和蛋白質(zhì)尚不清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為解決這一問(wèn)題提供了可能。本研究使用TMT標(biāo)定定量分析來(lái)構(gòu)建綿羊頭、體和尾部3個(gè)區(qū)域精子的蛋白質(zhì)組譜。成功鑒定出了307、167、140個(gè)差異表達(dá)蛋白，雖然富集的通路多與代謝相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)了位于精子頭部的入核載體蛋白亞基KPNA4，且差異倍數(shù)排名靠前。KPNA4的表達(dá)水平通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證，結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致，排除測(cè)序結(jié)果假陽(yáng)性的可能。

精子發(fā)生過(guò)程中，頂體位于凝聚核的一側(cè)，染色體主要由魚精蛋白而非組蛋白組成，盡管精子在睪丸中已呈現(xiàn)出特有形狀，但其功能并不成熟。精子成熟伴隨著精子活力和能量代謝的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和小RNA等物質(zhì)的含量均發(fā)生變化，附睪通過(guò)離子運(yùn)輸、囊泡分泌等途徑為精子成熟提供合適的環(huán)境。核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是哺乳動(dòng)物配子發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素。核孔復(fù)合體(NPC)是嵌入雙層核膜并介導(dǎo)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的分子運(yùn)輸?shù)木薮蟮鞍踪|(zhì)，允許小于40 ku的分子被動(dòng)擴(kuò)散，蛋白質(zhì)、mRNA等大分子物質(zhì)則需主動(dòng)運(yùn)輸。Ran作為重要分子，調(diào)節(jié)貨物受體復(fù)合物的組裝和解體，在核內(nèi)主要是RanGTP形式，在核外主要為RanGDP形式。需要入核的蛋白質(zhì)與核定位信號(hào)(NLS)結(jié)合，被受體蛋白importin-α識(shí)別，后者識(shí)別并結(jié)合importin-β 形成三聚體復(fù)合物，通過(guò)核孔蛋白上的多個(gè)苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重復(fù)序列，該復(fù)合物中的importin-β與NPC發(fā)生相互作用，這使得該復(fù)合物能夠轉(zhuǎn)移到核質(zhì)中。在小鼠中，目前已知的importin-α有7種(impα1、impα2、impα3、impα4、impα6、impα7、impα8)，不同亞型之間的區(qū)別為NLS結(jié)合特異性。有研究表明，4基因敲除的雄性小鼠比對(duì)照組小鼠生育力低，產(chǎn)仔數(shù)少，頂體反應(yīng)受到損害。體外受精和精子活力測(cè)定表明，來(lái)自4缺失小鼠的精子質(zhì)量和活力顯著降低。精子成熟和發(fā)生過(guò)程伴隨著大量物質(zhì)的合成、代謝與運(yùn)輸，KPNA4作為入核運(yùn)輸?shù)鞍?，在此過(guò)程中行使著重要功能。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)綿羊附睪頭、體和尾部精子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，本研究確定了表達(dá)量提高的KPNA4可能是參與精子成熟過(guò)程的相關(guān)蛋白，與物質(zhì)的核質(zhì)跨膜運(yùn)輸有關(guān)。本研究從分子層面展示了精子在附睪運(yùn)輸過(guò)程中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，挖掘可能調(diào)控精子成熟的生物學(xué)機(jī)制，并為后續(xù)研究提供了豐富的資源和依據(jù)。