魏媛媛，樊藝萌，袁燕燕，尕 玉，張艷楠，韓俊成，郝智慧

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100089)

肝是主要的代謝器官，它在運(yùn)動(dòng)和饑餓期間將血液中的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸轉(zhuǎn)化為肝外組織必需的代謝燃料。此外，肝中關(guān)鍵的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程也會(huì)轉(zhuǎn)化內(nèi)源性和外源性化合物，以加速它們從體內(nèi)的清除。肝損傷可能由藥物、感染或遺傳疾病引起。這些肝毒性物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)，從而誘發(fā)炎癥、免疫調(diào)節(jié)、肝硬化和肝部疾病。肝病已成為影響人類健康的最常見(jiàn)疾病之一。CCl是一種可導(dǎo)致化學(xué)性肝損傷的化合物，包括炎癥和纖維化，通常用于誘導(dǎo)小鼠模型的急性肝損傷。CCl的毒性作用會(huì)導(dǎo)致肝組織局部壞死；受損的肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和活化的庫(kù)普弗細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期以來(lái)，急性肝損傷是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。在保護(hù)肝損傷方面，中醫(yī)藥一直是臨床和試驗(yàn)研究的關(guān)注焦點(diǎn)。

茵山蓮是由東漢醫(yī)圣張仲景治療黃疸病名方“茵陳蒿湯”加減化裁而來(lái)，由茵陳、梔子、半枝蓮、板藍(lán)根、五味子、甘草等6味中藥組成，用于治療急慢性肝炎、膽囊炎、胰腺炎等，研究發(fā)現(xiàn),茵山蓮能顯著升高急性胰腺炎患者外周血T-SOD，降低血清丙二醛(MDA)、IL-2、TNF-α水平。茵陳是治療各種肝病和黃疸的方劑中最重要和最常用的中藥之一，已有研究報(bào)道茵陳可迅速降低轉(zhuǎn)氨酶，抑制肝細(xì)胞變性和壞死，保護(hù)肝組織；甘草、五味子有效成分可抑制肝中膠原的合成，防止肝纖維增生，降低肝硬化發(fā)生率，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，甘草和五味子可通過(guò)抗氧化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和加速新陳代謝等多靶點(diǎn)減輕藥物肝毒性，緩解肝損傷。茵陳蒿湯可通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶T-SOD的表達(dá)和活性來(lái)減弱肝脂質(zhì)過(guò)氧化并降低MDA和GST水平，從而改善CCl誘導(dǎo)的肝損傷。但是目前尚未有研究報(bào)道茵山蓮對(duì)急性肝損傷的作用機(jī)制，因此,本研究旨在探討茵山蓮水提物對(duì)CCl所致急性肝損傷的保護(hù)作用，并揭示其作用機(jī)制，為治療肝損傷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

四氯化碳(CCl，Sigma，C805332，純度>98%)，玉米油購(gòu)自麥克林公司；聯(lián)苯雙酯滴丸(國(guó)藥準(zhǔn)字H11020980)購(gòu)自北京協(xié)和藥廠；茵山蓮藥材(茵陳、半枝蓮、五味子、梔子、甘草、板藍(lán)根按2∶5∶1∶1∶1∶1比例配伍)購(gòu)自中國(guó)北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)定試劑盒(A004-1-1)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒(A001-1)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(A007-1-1)和總蛋白定量(TP)測(cè)定試劑盒(A045-3)購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；琥珀酸脫氫酶(SDH)活性檢測(cè)試劑盒(BC0955)，Massson三色染色液(固綠法，G1343)、蘇木精染色液(G1140)、伊紅染色液(G1100)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(P1200)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Page Ruler Prestained Protein Ladder(#26618)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；即用型SABC-AP(小鼠/兔IgG)試劑盒(SA1050)購(gòu)自博士德生物工程有限公司(武漢)；NF-κBp65抗體(ab32536)、IKK抗體(ab3204)、VEGFA抗體(ab1316)、p38MAPK抗體(ab170099)、IL-1β抗體(ab9722)、TNF-α抗體(ab6671)、MMP9抗體(ab228402)、β-actin(ab8227)抗體購(gòu)自Abcam公司；山羊抗兔抗體HRP標(biāo)記(S0101)購(gòu)自蘭博利德公司；化學(xué)發(fā)光液(HY-K1005)購(gòu)自MCE公司。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Infinite 200 pro，TECAN,奧地利)，光學(xué)顯微鏡(DS-Ri2, Nikon, 日本)，多功能成像儀(Amersham ImageQuant 800 imaging system，Cytiva, 美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

60只8周齡SPF級(jí)ICR小鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司(生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2019-0010)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日給予光照、黑暗各12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(25±0.5)℃，濕度50%～60%，自由采食和飲水。之后隨機(jī)分為6組(=10)， 分別為A、B、C、D、E、F組。A組為空白對(duì)照組，每只小鼠灌胃0.2 mL生理鹽水；B組為模型對(duì)照組，每只小鼠灌胃0.2 mL生理鹽水；C組為聯(lián)苯雙酯對(duì)照組，每只小鼠按200 mg·kg(BW)劑量灌胃等體積聯(lián)苯雙酯溶液；D、E、F組分別為茵山蓮低、中、高劑量組，分別按1.17、2.34、4.68 mg·g茵山蓮水提物灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d。劑量參考人醫(yī)臨床給藥劑量3 g，低、中、高劑量分別按人藥劑量的3、6和12倍給藥，并由人和小鼠體表面積折算系數(shù)9.01計(jì)算所得。末次給藥1 h后，用藥組小鼠按0.1 mL每10 g(BW)劑量腹腔注射0.2% CCl溶液，使用玉米油進(jìn)行CCl的原液稀釋，空白對(duì)照組腹腔注射等量玉米油，12 h后眼球采血，分離血清，收集肝組織，一半固定于10%福爾馬林，一半凍存于-80 ℃(圖1)。本研究中動(dòng)物處理過(guò)程通過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的動(dòng)物倫理學(xué)審查。

圖1 茵山蓮水提物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷作用的試驗(yàn)流程Fig.1 Procedure and methods of the study of YSL aqueous extract effect on acute liver injury induced by CCl4

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血清總蛋白含量測(cè)定 小鼠眼球采血后，3 500×離心15 min，吸取上層澄清血清，按血清∶ 生理鹽水=1∶49比例稀釋，參考血清總蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)加入工作液，562 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，計(jì)算血清總蛋白濃度。

1.3.2 血清和肝GST活力測(cè)定 常規(guī)制備10%組織勻漿和待測(cè)血清。按南京建成GST活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入基質(zhì)液，血清或組織勻漿樣本，應(yīng)用液等試劑，412 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，計(jì)算GST酶活力。

1.3.3 肝SDH活性檢測(cè) 取10%肝組織勻漿，按生產(chǎn)商試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相關(guān)試劑后，37 ℃孵育10 min，在600 nm波長(zhǎng)下記錄OD值。按相應(yīng)公式計(jì)算SDH活性。

1.3.4 肝CAT和T-SOD測(cè)定 取10%肝組織勻漿，分別按CAT和T-SOD測(cè)定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)加入樣品和試劑，于405 nm和550 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，計(jì)算CAT和T-SOD活力。

1.3.5 肝組織病理學(xué)及肝纖維化觀察 常規(guī)方法制備石蠟切片，二甲苯和梯度酒精進(jìn)行脫蠟至水，蘇木精染色10 min后，鹽酸酒精分化，氨水復(fù)藍(lán)，伊紅染色2 min，梯度酒精和二甲苯脫水透明后封片，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

切片脫蠟至水后，用Weigert鐵蘇木素染色10 min， 酸性乙醇適度分化，水洗后用Masson藍(lán)化液返藍(lán)，蒸餾水洗，麗春紅品紅染色7 min，弱酸液和磷鉬酸溶液分別洗1 min，進(jìn)入固綠染色液中染色2 min，弱酸水洗后，用95%乙醇和無(wú)水乙醇快速脫水，透明封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察肝纖維化水平。肝纖維化水平參考Ishak評(píng)分系統(tǒng)(表1)。

表1 肝纖維化Ishak評(píng)分系統(tǒng)Table 1 Ishak scoring system for liver fibrosis

1.3.6 肝組織炎性因子相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 使用總蛋白提取試劑盒提取肝組織蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)得蛋白濃度。每孔40 μg蛋白上樣后進(jìn)行電泳，以將等量的蛋白質(zhì)提取物分離到10%聚丙烯酰胺凝膠上并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，將膜與NF-κBp65抗體(1∶1 000)、IKK抗體(1∶1 000)、VEGFA抗體(1∶1 000)、p38MAPK抗體(1∶1 000)、IL-1β抗體(1∶1 000)、TNF-α抗體(1：1 000)、MMP9抗體(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜。TBST清洗5 min×3次后，山羊抗兔抗體室溫孵育3 h，TBST清洗5 min×3次后用化學(xué)發(fā)光液在顯影儀中進(jìn)行顯影。

1.3.7 肝組織NF-κBp65、IKK、VEGFA蛋白定位觀察 常規(guī)方法制備石蠟切片，脫蠟至水后按照即用型SABC-AP(小鼠/兔IgG)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行抗原修復(fù)，抗體孵育等操作，使用BCIP/NBT體系進(jìn)行顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察深紫色陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多重比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，方差不齊時(shí)，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。采用SNK事后檢驗(yàn)。<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 茵山蓮水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷生化指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組相比，CCl腹腔注射后，小鼠血清總蛋白(TP)水平顯著升高(<0.05)，聯(lián)苯雙酯藥物、中和低劑量的茵山蓮水提物處理后，血清TP與空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均沒(méi)有顯著差異(>0.05)，與空白對(duì)照組相比，高劑量茵山蓮組小鼠血清總蛋白水平顯著提高(<0.05)。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清GST活力顯著升高(<0.05)，而與模型對(duì)照組相比，聯(lián)苯雙酯和高、中、低劑量茵山蓮均能顯著降低血清GST活力，其中低劑量茵山蓮水提物組與空白組無(wú)顯著差異(>0.05)。而肝組織中，空白對(duì)照組GST與模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組以及中、低劑量茵山蓮組GST活性無(wú)顯著差異(>0.05)，但高劑量茵山蓮能顯著提高肝GST活力且與空白組有顯著差異(<0.05)。0.2% CCl能顯著降低肝SDH和CAT活力(<0.05)，而與模型對(duì)照組相比，聯(lián)苯雙酯和中劑量茵山蓮水提物均能顯著提高CAT活力(<0.05)，并且中劑量茵山蓮組與空白組和聯(lián)苯雙酯組均沒(méi)有顯著差異(>0.05)。肝組織內(nèi)T-SOD活力在各組間沒(méi)有顯著差異(>0.05，圖2)。

不同小寫字母表示組間有顯著差異(P<0.05)，下同Different lowercase letters showed significant differences among groups (P<0.05), the same as below圖2 茵山蓮水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of YSL aqueous extract on biochemical parameters in acute liver injury induced by CCl4

2.2 茵山蓮水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的組織學(xué)和纖維化水平觀察

觀察HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。0.2% CCl腹腔注射后，小鼠肝內(nèi)有淤血沉積，壞死部位的肝細(xì)胞形態(tài)腫脹，失去正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小，細(xì)胞間界限不清楚，出現(xiàn)似疤痕樣變化，肝索放射樣排列遭到破壞，Masson染色也可觀察到肝纖維組織增生。而聯(lián)苯雙酯和高、中、低茵山蓮處理后，肝細(xì)胞的形態(tài)得到一定恢復(fù)，疤痕樣變化減輕，肝纖維組織的增生也得到了一定遏制(圖3a、3b)，并且肝纖維化評(píng)分降低(圖4)。

a. HE染色；b. Masson染色。A.空白對(duì)照組；B. CCl4模型組；C. 聯(lián)苯雙酯組；D. 茵山蓮低劑量組；E茵山蓮中劑量組；F. 茵山蓮高劑量組。→表示結(jié)構(gòu)受損的肝細(xì)胞；▲表示纖維組織a. HE staining; b. Masson staining. A. Blank control group; B. CCl4 model group; C. Biphenyl diester group; D. YSL low dose group; E. YSL medium dose group; F. YSL high dose group. → indicates structurally damaged hepatocytes; ▲ indicates fibrous tissue圖3 茵山蓮水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的組織學(xué)和纖維化水平觀察Fig.3 Observation of YSL aqueous extract on histology and fibrosis in acute liver injury induced by CCl4

圖4 茵山蓮水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的組織纖維化水平Ishak評(píng)分Fig.4 Ishak score of YSL aqueous extract on histology and fibrosis in acute liver injury induced by CCl4

2.3 茵山蓮水提物對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織炎性及組織基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

CCl腹腔注射后肝組織炎性蛋白TNF-α、IL-1β、p38MAPK、NF-κBp65、IKK和組織基質(zhì)相關(guān)蛋白VEGFA、MMP9與空白對(duì)照組相比表達(dá)均顯著升高(<0.05)。與模型對(duì)照組相比，聯(lián)苯雙酯和中劑量茵山蓮水提物顯著降低了TNF-α、IL-1β、p38MAPK、NF-κBp65、IKK和組織基質(zhì)相關(guān)蛋白VEGFA、MMP9的表達(dá)(<0.05，圖5)。

圖5 茵山蓮水提物對(duì)急性肝損傷小鼠肝炎性及組織基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of YSL aqueous extract on hepatic inflammatory and tissue matrix related proteins expression in acute liver injury

2.4 茵山蓮水提物對(duì)急性肝損傷小鼠肝VEGFA、NF-κBp65和IKK蛋白表達(dá)及定位的影響

如圖6所示，與空白組相比，CCl對(duì)照組VEGFA、NF-κBp65和IKK蛋白表達(dá)均增加，且集中在肝細(xì)胞壞死，纖維組織附近。聯(lián)苯雙酯和各個(gè)劑量茵山蓮水提物不同程度地減少了VEGFA、NF-κBp65和IKK蛋白表達(dá)。

3 討 論

本研究討論了茵山蓮水提物對(duì)CCl誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。組織學(xué)觀察顯示CCl引起了肝細(xì)胞廣泛的壞死和纖維化，但預(yù)先給小鼠灌胃聯(lián)苯雙酯或2.34 mg·g茵山蓮水提物，其病理變化極大減少。纖維化本質(zhì)上是一種傷口愈合反應(yīng)，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的長(zhǎng)期積累。ECM的過(guò)度沉積會(huì)引起不可逆的纖維化反應(yīng)，并導(dǎo)致永久性纖維化疤痕的形成，最終導(dǎo)致器官衰竭。作為最常見(jiàn)的組織纖維化類型之一，肝纖維化與肝功能障礙有關(guān)，幾乎可以在所有類型的急慢性肝病中觀察到，無(wú)論病因如何，在很大程度上，肝組織炎癥和肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化的基本反應(yīng)，它導(dǎo)致一系列變化，如纖維化基因的表達(dá)、血管和器官的收縮以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，試驗(yàn)中2.34 mg·g茵山蓮水提物顯著抑制了肝纖維化進(jìn)程，為后續(xù)緩解急性肝損傷奠定了組織基礎(chǔ)。

此外，肝和血清生化指標(biāo)檢測(cè)也顯示不同劑量茵山蓮水提物具有護(hù)肝作用：小鼠暴露于0.2% CCl后，血清GST活力和總蛋白水平均異常升高，而肝GST活力卻沒(méi)有顯著變化。GST是一類廣泛分布于生物體的多功能解毒酶系，主要存在于肝、腎中，參與許多內(nèi)外源有毒物質(zhì)的代謝，并可轉(zhuǎn)運(yùn)一些重要的親脂性化合物，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能。由于肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，肝內(nèi)GST酶活失去反應(yīng)性，因此血清中GST酶活可能發(fā)生了代償性異常升高，而預(yù)先灌胃聯(lián)苯雙酯或不同劑量茵山蓮水提物則可顯著降低其水平，恢復(fù)肝內(nèi)GST活力。同理，肝細(xì)胞膜破壞，肝內(nèi)重要的氧化還原酶和代謝酶T-SOD、SDH、CAT等酶的活性或含量出現(xiàn)了不同程度的下降，而外漏的各類酶使血清總蛋白含量升高，2.34 mg·g茵山蓮水提物抑制了肝T-SOD、SDH、CAT的流失和活力降低，從而也能降低血清總蛋白含量。

A.空白對(duì)照組；B. CCl4模型組；C. 聯(lián)苯雙酯組；D. 茵山蓮低劑量組；E茵山蓮中劑量組；F. 茵山蓮高劑量組A. Blank control group; B. CCl4 model group; C. Biphenyl diester group; D. YSL low dose group; E. YSL medium dose group; F. YSL high dose group圖6 茵山蓮水提物對(duì)急性肝損傷小鼠肝VEGFA、NFκBp65和IKK蛋白表達(dá)及定位的影響Fig.6 Effects of YSL aqueous extract on the protein expression and localization of VEGFA，NFκBp65 and IKK in acute liver injury induced by CCl4

為了進(jìn)一步探究茵山蓮水提物的保肝作用，運(yùn)用蛋白免疫印跡和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了茵山蓮水提物對(duì)重要信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)因子的影響，以便討論茵山蓮水提物護(hù)肝作用的分子機(jī)理。氧化應(yīng)激與肝疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的炎癥密切相關(guān)。茵山蓮水提物的抗氧化和抗炎機(jī)理可能是減輕肝損傷的關(guān)鍵機(jī)制，氧化應(yīng)激能促進(jìn)Toll 樣受體 (TLR) 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這些反應(yīng)通路對(duì)于肝疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。NF-κB信號(hào)通路是最重要的TLR激活下游轉(zhuǎn)錄因子之一，可驅(qū)動(dòng)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。一旦TLR被激活，IKK就會(huì)磷酸化并激活NF-κB的抑制劑 (IκB)，導(dǎo)致IκB泛素化并進(jìn)一步降解，致使NF-κB亞型p65和 p50的釋放、核易位，從而激活炎癥反應(yīng)。與前人研究相一致，本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量茵山蓮水提物能夠降低CCl誘導(dǎo)急性肝損傷肝組織纖維化周圍NF-κBp65、IKK的蛋白表達(dá)，并能顯著降低肝內(nèi)p38MAPK凋亡相關(guān)蛋白因子和VEGFA、MMP9等基質(zhì)沉積相關(guān)因子表達(dá)。劑量依賴性抑制TNF-α和 IL-1β 在肝的表達(dá)。

4 結(jié) 論

茵山蓮水提物對(duì)CCl誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用主要表現(xiàn)在抗氧化和抗炎作用，其可以通過(guò)p38 MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)緩解CCl急性肝損傷作用。