林煥樂 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學院食品與藥學學院 醫(yī)學院，浙江 舟山 316004

蝦蛄多肽的酶解工藝及其抗腫瘤活性的初步研究

林煥樂 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學院食品與藥學學院 醫(yī)學院，浙江 舟山 316004

目的：通過正交試驗優(yōu)化酶解條件，提取分離蝦蛄軟體組織，根據(jù)其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。方法：采用L16（45）正交試驗設計方法，通過探索其抗前列腺癌作用，優(yōu)化胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的提取條件。結(jié)果：蝦蛄多肽酶解最佳條件為：料液比1∶2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時間為4h，其對前列腺癌PC－3細胞株的體外抑制率為60.9%。結(jié)論酶解所得的蝦蛄多肽對前列腺癌細胞具有一定的抑制生長作用。

蝦蛄多肽；酶解；前列腺癌細胞；正交試驗

近年來，有關生物活性肽的研發(fā)極為活躍，目前已有多種產(chǎn)品問世。來自海洋生物的活性肽盡管研發(fā)歷史較短，但因其具有的獨特生理功能而異軍突起，成為活性肽領域的研究熱點。海洋生物活性物質(zhì)抗腫瘤研究是海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)與抗癌藥物研究的一個重要領域。從眾多的海洋生物中尋找有效的抗癌藥物，提取制備海洋生物活性物質(zhì)并對其抗腫瘤活性進行篩選是其中的研究重點［1－3］。

蝦蛄在江浙一帶俗稱蝦拔彈、蝦鉤彈，在北方一帶俗稱蝦爬子，日本人稱之為螳螂蝦。它隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、口足目。蝦蛄與其他品種相比，具有能自然越冬、抗害避難和養(yǎng)殖風險小的優(yōu)點，值得推廣養(yǎng)殖［4］。近年來，規(guī)模化養(yǎng)殖蝦蛄的水產(chǎn)業(yè)越來越多。本文采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織，通過正交試驗優(yōu)化酶解條件，提取制備蝦蛄多肽，研究其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。

1 儀器與材料

1.1 材料 蝦蛄采集自舟山群島海域；前列腺癌細胞PC－3（原購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存）；胰蛋白酶等試劑均為國藥集團化學試劑有限公司 （分析純）。

1.2 主要儀器與設備 HH－S型水浴鍋（鞏義予華儀器有限責任公司）；FD－1000冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；BS－100A自動部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；CR21G冷凍離心機（日本日立）；DHG－9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；FiveEosy實驗室pH計；JJ－2組織搗碎機（上海梅香儀器有限公司）；RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；EYELA CA－III循環(huán)冷凍儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHB－III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技有限公司）；Sephadex G－25凝膠柱。

2 實驗方法

2.1 酶解工藝 酶解工藝參照Sheih等［5］的方法，采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織。將蝦蛄洗凈去殼，將蝦蛄肉進行勻漿，用0.1mol/L的HCl和0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值，加入胰蛋白酶進行保溫水解，水解完成后100℃、10min進行滅酶，將水解液8000r/min離心20min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。

2.2 細胞培養(yǎng) 選取人前列腺癌細胞PC－3（原購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存），用含10%胎牛血清的F12完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，0.25%的胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次，實驗時選用對數(shù)生長期細胞。

2.3 細胞增殖抑制率的測定 采用MTT法檢測。配制PBS溶液（pH值為7.2）和分別配置上述16組正交實驗的蝦蛄多肽溶液。取對數(shù)生長期的前列腺癌PC－3細胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。然后分別加入不同酶解工藝制得的蝦蛄多肽（10mg/mL），每組分別設3個平行孔，同時設不加藥作為對照組，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育72h。培養(yǎng)結(jié)束后，加PBS溶液（pH值為7.2）清洗3次，再加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄MTT，加二甲基亞砜每孔150μL，置酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測吸光度，計算細胞增殖抑制指數(shù)（IR），按下列公式計算：

2.4 酶解工藝的影響因素和優(yōu)化 觀察A（料液比）、B（pH）、C（加酶量）、D（溫度）、E（時間）等因素對酶解工藝的影響，每個因素選四個水平進行L16（45）的正交實驗，比較胰蛋白酶在不同水解條件下的抗腫瘤活性，從而確定最佳酶解條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解工藝條件對抗腫瘤活性的影響

3.1.1 料液比對PC－3細胞增殖抑制率的影響

如圖1所示：在一定的料液比例下，隨著料液比的增

加，抗腫瘤活性下降，但當比例繼續(xù)增大時，抑制率又有所增加，料液比對胰酶酶解蝦蛄多肽有較大的影響。本實驗測得當料液比為1：2時，抗腫瘤活性最優(yōu)。

3.1.2 pH值對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖2所示：在一定的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，抗腫瘤活性呈現(xiàn)先上升趨勢，再繼續(xù)增加pH值，抗腫瘤活性又有所下降，繼而又緩慢上升。本實驗測得當pH值為7.5時抗腫瘤活性最高。

3.1.3 加酶量對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖3所示：加酶量的改變，蝦蛄抗腫瘤活性呈現(xiàn)交替現(xiàn)象，當加酶量為500－1000u時抗腫瘤活性增加；當加酶量為1000－1500u時，抗腫瘤活性下降；繼續(xù)增加500u抗腫瘤活性又呈現(xiàn)下降趨勢。

3.1.4 酶解溫度對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖4所示，酶解溫度對胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的抗腫瘤活性變化明顯。在一定范圍內(nèi)，隨著溫度增加，抗腫瘤活性上升，繼續(xù)增加溫度，抗腫瘤活性又下降。當溫度為40℃時，抗腫瘤活性最佳。

3.1.5 酶解時間對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖5所示：隨著酶解時間的增加，抗腫瘤活性先緩慢增加，繼而呈現(xiàn)迅速下降，再逐漸趨于平緩。其中，4h時的抗腫瘤活性最強?？梢姡附鈺r間對胰酶酶解蝦蛄多肽有一定的影響，以4h最優(yōu)。

3.2 正交實驗優(yōu)化酶解工藝

表1 Trypsin正交試驗設計及結(jié)果L16（45）

結(jié)果表明，影響前列腺癌PC－3細胞增殖抑制率的各因素的主次順序為：A（料液比）＞E（時間h）＞D（溫度℃）＞C（加酶量u/g）＞B（pH值）。IR值最大時的水解條件為A1B2C2D2E2，即料液比為料液比1：2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時間為4h，其對前列腺癌PC－3細胞株的體外抑制率為60.9%。

4 討論

本實驗針對蝦蛄多肽體外抗前列腺癌PC－3細胞活性進行了正交試驗分析，篩選出了胰蛋白酶酶解的最優(yōu)條件，其抗腫瘤活性多肽的進一步分離純化以及作用機制有待于深入研究。

［1］歐陽高亮，李祺福，田長海.海洋生物抗腫瘤活性物質(zhì)及其作用機理研究進展［J］.海洋科學，2003，27（7）：21－24.

［2］李盛英，鄭忠輝.國外海洋抗腫瘤活性物質(zhì)的研究與開發(fā) ［J］.海洋通報，2003，22（2）：76－82.

［3］洪水根.海洋生物活性物質(zhì)在腫瘤治療及臨床檢測中的應用 ［J］.廈門科技，2003，2：55－58.

［4］曹根庭，裘迪紅，張義浩，等.蝦蛄的綜合利用 ［J］.浙江水產(chǎn)學院學報，1996，15（1）：74－76.

［5］Sheih JC，Wu TK，F(xiàn)ang TJ.Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation saystems［J］. Bioresour Technol，2009，100：3419－3425.

R931.4

A

1007－8517（2013）10－0016－03

2013.04.15）

林煥樂（1990－），女，大學本科.

馬劍茵※（1962－），女，教授，碩士生導師，從事海洋生物活性成分的藥理研究.E－mail：chymjy＠zjou.edu.cn.