黃育生袁賢琳鐘 瑜王汝俊

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 510405；2.廣東省廣州花海藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510370

HPLC法測(cè)定羌活中紫花前胡苷的含量

黃育生1袁賢琳2*鐘 瑜2王汝俊1

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 510405；2.廣東省廣州花海藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510370

目的：建立HPLC法測(cè)定羌活中紫花前胡苷含量的方法。方法：HPLC條件：色譜柱為Agilent HC－C18柱（5μm，4.6× 250mm），流動(dòng)相為甲醇－水（32∶68），流速為1.0ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，柱溫為35℃。結(jié)果紫花前胡苷范圍為4.00μg·ml－1～100.00μg·ml－1，平均回收率為99.90%，RSD為1.50%。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測(cè)定方法提供參考依據(jù)。

羌活；紫花前胡苷；HPLC

羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或?qū)捜~羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.的干燥根莖和根。本品具有解表散寒，祛風(fēng)除濕，止痛的功效，常用于治療風(fēng)寒感冒，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，風(fēng)濕痹痛，肩背酸痛［1］。其主要成分有香豆素類成分 （如紫花前胡苷、羌活醇及異歐前胡素等）、揮發(fā)油、阿魏酸等［2］。有研究表明紫花前胡苷是羌活的有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用［3］。但是2010年版藥典第一部只收載了羌活醇和異歐前胡素總量的含量測(cè)定方法，且目前對(duì)于HPLC法測(cè)定羌活中的紫花前胡苷含量的報(bào)道很少。本文研究建立了HPLC法測(cè)定羌活中的紫花前胡苷含量，為羌活的質(zhì)量控制及復(fù)方制劑中羌活的有效成分轉(zhuǎn)移率提供新的參考依據(jù)。結(jié)果表明本方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：SPD－20A紫外檢測(cè)器，LC－20AT泵（日本島津公司）；Sartorious BT 25S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州澳華儀器有限公司）；KQ－100DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

羌活中藥飲片（批號(hào)20100702，佛山市中藥飲片廠有限公司）；紫花前胡苷對(duì)照品（批號(hào)111821－201102，中國(guó)食品藥品檢定研究所）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

Agilent HC－C18色譜柱（5μm，4.6×250mm）；流動(dòng)相：甲醇－水（32∶68）；流速：1ml·min－1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：335nm。紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均在1.5以上，理論板數(shù)按紫花前胡苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取藥材粉末 （過三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50m l，稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)盟s20ml使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25ml量瓶中，稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液5μl和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，見圖1。

3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取紫花前胡苷對(duì)照品5.00mg置于25m l的量瓶，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.20mg ·m l－1的對(duì)照品溶液貯備液，分別精密量取上述貯備液0.2、0.5、1、2、3、4、5ml，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為4.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg·m l－1的梯度對(duì)照品溶液，精密量取上述梯度對(duì)照品溶液各5μl，按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液 （μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：紫花前胡苷濃度在4.00μg ·m l－1～100.00μg·ml－1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y＝270.85＋1.3598×104X，r＝0.9999。

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液5μl連續(xù)進(jìn)樣

6次，記錄峰面積，計(jì)算紫花前胡素峰面積的RSD（n＝6）為0.4%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按供試品溶液制備方法平行制備6組供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果樣品中紫花前胡苷的平均含量（n＝6）為0.266%，RSD為2.9%。

3.7 穩(wěn)定性考察 取同一個(gè)供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果紫花前胡苷峰面積的RSD（n＝7）為0.3%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取“3.6”項(xiàng)下已知紫花前胡苷含量的羌活藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.25g，分取6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.0133mg·m l－1的對(duì)照液50m l（精密稱取紫花前胡苷對(duì)照品6.65mg，置于500ml量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.0133mg·ml－1的對(duì)照液），稱定重量，超聲30min。放冷，再稱定重量，用濃度為0.0133mg/m l的對(duì)照液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，按 “3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率（n＝6）為99.64%，RSD為1.22%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.9 樣品測(cè)定 取產(chǎn)地為四川的羌活藥材，共5批，按“3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 不同批次羌活的紫花前胡苷含量

4 討論

4.1 樣品萃取純化 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只對(duì)羌活進(jìn)行超聲處理，供試品中雜質(zhì)較多，而用水飽和正丁醇萃取之后與前者比較，雜質(zhì)大大減少，并且紫花前胡苷的含量無明顯差異，故從保護(hù)色譜系統(tǒng)，減少雜質(zhì)干擾方面考慮，選擇用水飽和正丁醇處理純化供試品溶液。試驗(yàn)比較結(jié)果亦表明萃取四次后，第五次的萃取液幾乎不含紫花前胡苷。

4.2 樣品提取方法的選擇 試驗(yàn)中對(duì)加熱回流提取1h和超聲處理30min的樣品中的紫花前胡苷提取效果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明兩種方法對(duì)紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，但超聲處理方法簡(jiǎn)便快捷，故選擇超聲處理30min。

4.3 提取溶劑的選擇 試驗(yàn)中對(duì)比了甲醇和50%甲醇對(duì)紫花前胡苷提取效果的影響，結(jié)果表明，兩者對(duì)紫花前胡苷的提取效果無明顯差異，故從成本及環(huán)保等方面考慮，選擇50%甲醇為提取溶劑。

4.4 超聲時(shí)間的選擇 試驗(yàn)中對(duì)比了20、30、40min三個(gè)超聲時(shí)間對(duì)紫花前胡苷提取效果的影響，結(jié)果表明30min和40min的提取效果無明顯差異，而比20min的提取效果略高，故選擇超聲處理30min。

4.5 吸收波長(zhǎng)與流動(dòng)相比例選擇 取紫花前胡苷對(duì)照品的甲醇溶液，在紫外分光光度計(jì)190～400nm波長(zhǎng)掃描。結(jié)果在335nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇335nm為本品的測(cè)定波長(zhǎng)，見圖2。

流動(dòng)相甲醇－水的比例調(diào)節(jié)為32：68時(shí)，紫花前胡苷峰與前后峰的分離度均大于1.5。

4.6 孫玉茹等［4］的研究，流動(dòng)相為甲醇－水－乙腈（6∶71∶21）測(cè)定羌活中紫花前胡苷含量，紫花前胡苷的保留時(shí)間較小，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，供試品雜質(zhì)較多，較小保留時(shí)間可能會(huì)有峰的重疊，分離度不符合要求。朱美曉等［5］的研究，以乙腈－水（15∶85）為流動(dòng)相，使用不同色譜柱Phenomenex Synergi4u Hydro－RPC18，Phenomenex Luna C18和Agilent Extend－C18測(cè)定羌活中紫花前胡苷含量，只有Phenomenex Synergi4u Hydro－RP C18能達(dá)到最佳分離效果，而其他色譜柱都不能有效分離。而本試驗(yàn)使用Agilent HCC18色譜柱（5μm，4.6×250mm），以甲醇－水（32∶68）亦能達(dá)到有效分離。

某些中藥亦含有紫花前胡苷，如紫花前胡、前胡等，并有HPLC法紫花前胡苷含量測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［6］文獻(xiàn)報(bào)道［7］。

本試驗(yàn)參考上述相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的方法，考察各個(gè)因素對(duì)紫花前胡苷提取效果及HPLC色譜分離效果的影響，最終優(yōu)化建立了HPLC法測(cè)定羌活中紫花前胡苷含量的方法，該法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為羌活中紫花前胡苷的含量測(cè)定方法提供參考依據(jù)。尤其是中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，使用水飽和正丁醇萃取可有效地純化紫花前胡苷，減少雜質(zhì)，這對(duì)含羌活的復(fù)方制劑的質(zhì)量控制有重大的參考意義。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 （一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：170.

［2］李云霞，高春華.中藥羌活化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 ［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6（1）：22－23.

［3］秦彩玲，張毅，劉婷，等.中藥羌活有效成分的篩選試驗(yàn) ［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，25（10）：639.

［4］孫玉茹，李先端，孫有富.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地羌活中紫花前胡苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26（11）：737.

［5］朱美曉，陳燕，易進(jìn)海，等.羌活藥材薄層色譜鑒別與含量測(cè)定 ［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（1）：116－117.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 （一部）.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：317－318.

［7］徐勤，劉布鳴.高效液相色譜法測(cè)定前胡屬植物中紫花前胡苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2000，25（12）：731－732.

Determination of the contents of nodakenin in Notopterygii Rhizoma et Radix by HPLC

HUANG Yu－sheng1，YUAN Xian－lin2*，ZHONG Yu，WANG Ru－jun1

objective：To establish a method for determination of the contents of nodakenin in Notopterygii Rhizoma et Radix by HPLC.Methods：The chromatographic condition：Agilent HC－C18 column（5μm，4.6×250mm），CH3OH－H2O（32－68）as mobile phase，the flow rate is1.0ml·min－1，the detection wavelength is335 nm，the column temperature is 35℃.Results：The calibration curves showed good linearlty in the range of 4.00μg·m l－1～100.00μg·ml－1，the average recoveries is 99.90%，RSD is 1.50%.Conclusion：This method is simple，with exact result and good repeatiton and can be used as the

for determination of the contents of nodakenin of Chinese medicine qianghuo.

Notopterygii Rhizoma et Radix；nodakenin；HPLC

R284.1

A

1007－8517（2013）10－0014－02

2013.03.26）