李寧，伍嚴(yán)安，胡辛蘭，吳長(zhǎng)生

(福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州350001)

結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)及耐藥情況分析

李寧，伍嚴(yán)安，胡辛蘭，吳長(zhǎng)生

(福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州350001)

目的比較結(jié)核分枝桿菌的3種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,了解出國(guó)體檢人群結(jié)核分枝桿菌的檢出率及耐藥情況。方法收集2010年1月至2012年12月福建省立醫(yī)院出國(guó)體檢中心1030例疑似結(jié)核病患者的3090份標(biāo)本的涂片鏡檢，羅氏固體培養(yǎng)，MGIT 960液體培養(yǎng)等3種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的結(jié)果，并對(duì)藥敏情況進(jìn)行分析。結(jié)果3種方法中，涂片鏡檢法檢測(cè)時(shí)間最短(2h)，但陽(yáng)性率最低(2.0%)；羅氏固體培養(yǎng)陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)間最長(zhǎng)(21.4d)，陽(yáng)性率為7.1%，污染率2.1%；MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)間為11.2d，陽(yáng)性率為9.2%，污染率4.3%。106株結(jié)核分枝桿菌中，74株對(duì)5種抗結(jié)核一線藥物全部敏感，耐吡嗪酰胺(PZA)的有25株，耐異煙肼(INH)的有13株，耐鏈霉素(SM)的有9株，耐利福平(RFP)的有4株，沒(méi)有出現(xiàn)耐乙胺丁醇(EMB)的菌株。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法中，MGIT 960液體培養(yǎng)時(shí)間較短，陽(yáng)性率最高。在5種抗結(jié)核一線藥物中，對(duì)PZA的耐藥率最高，其次是INH。

結(jié)核病；分枝桿菌屬；檢測(cè)；評(píng)價(jià)；耐藥性

被稱為白色瘟疫的結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的傳染病。據(jù)WHO的最新報(bào)告，2010年有大約880萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病，145萬(wàn)例死于結(jié)核病[1]。結(jié)核病診斷的理想方法應(yīng)是快速、特異、敏感，廣大地區(qū)和人群可以接受，能辨別結(jié)核分枝桿菌和環(huán)境中的非結(jié)核分枝桿菌，且不需昂貴儀器和專業(yè)培訓(xùn)的方法[2]。目前，國(guó)內(nèi)結(jié)核病主要的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法包括涂片鏡檢法、羅氏固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法、PCR基因檢測(cè)法等，其中涂片鏡檢和分枝桿菌的培養(yǎng)是結(jié)核病臨床診斷與鑒別的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。提高結(jié)核病的檢測(cè)速度，縮短藥敏結(jié)果的報(bào)告時(shí)間，對(duì)于結(jié)核病的早期診斷和合理用藥具有重要意義。福建省立醫(yī)院是福建省最大的綜合性醫(yī)院，同時(shí)擔(dān)負(fù)著美國(guó)、加拿大及澳洲出國(guó)人員結(jié)核病的篩查、診斷及治療任務(wù)。筆者收集了2010年1月至2012年12月福建省立醫(yī)院出國(guó)體檢中心1030例疑似結(jié)核病患者的3090份標(biāo)本的結(jié)核菌的涂片、培養(yǎng)和藥敏結(jié)果，現(xiàn)分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料福建省立醫(yī)院2010年1月至2012年12月出國(guó)體檢中心1030例疑似結(jié)核病患者的3090份痰標(biāo)本(每位患者都連續(xù)送3次)，其中男性患者575例，女性患者455例。

1.2 儀器和試劑BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，其配套試劑包括分枝桿菌液體培養(yǎng)管(MGIT培養(yǎng)管)、生長(zhǎng)添加劑、雜菌抑制劑(PANTA)、分枝桿菌聯(lián)合藥敏試劑盒(SIRE kit)和PZA藥敏試劑盒?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)儀LEADER 50I、AccuProbe探針檢測(cè)試劑盒及羅氏培養(yǎng)基由梅里埃公司生產(chǎn)。Mtb抗原檢測(cè)試劑(膠體金法)由杭州創(chuàng)新生物檢驗(yàn)技術(shù)公司生產(chǎn)。抗酸染液、革蘭染液購(gòu)自貝索公司。標(biāo)本前處理液：4%N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉(4%NALCNaOH)，pH6.8磷酸鹽緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理步驟按BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)操作指南完成，取沉渣0.5ml接種于MGIT培養(yǎng)管，同時(shí)取沉渣0.2ml接種于中性羅氏培養(yǎng)基，并進(jìn)行涂片，待涂片自然干燥后進(jìn)行抗酸染色，統(tǒng)計(jì)其初始涂片陽(yáng)性率。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)采用比例法，藥敏操作按照BACTEC MGIT 960操作指南完成。BACTEC MGIT 960能進(jìn)行鏈霉素(SM)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)五種一線抗結(jié)核藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，藥物終濃度分別為1.0、0.1、1.0、5.0和100μg/ml。藥敏質(zhì)量控制菌株為H37RV。

1.3.3 檢出陽(yáng)性結(jié)果的處理BACTEC MGIT 960儀器報(bào)告陽(yáng)性后，取出陽(yáng)性培養(yǎng)管，做兩張涂片，分別行抗酸染色和革蘭染色。若抗酸染色陽(yáng)性，視為分枝桿菌生長(zhǎng)；若抗酸染色陰性，需再行普通細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色，確定是否有其它細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)，若有即視為標(biāo)本污染。中性羅氏培養(yǎng)基置于37℃溫箱中孵育，每周觀察兩次，若發(fā)現(xiàn)可疑菌落，處理及判斷同BACTEC MGIT 960培養(yǎng)。BACTEC MGIT 960培養(yǎng)周期為42d，超過(guò)42d未報(bào)陽(yáng)視為陰性；中性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)周期為56d，超過(guò)56d未報(bào)陽(yáng)視為陰性。

1.3.4 菌型鑒定若涂片證實(shí)為分枝桿菌生長(zhǎng)，即取培養(yǎng)管中的培養(yǎng)物100μl，加于膠體金檢測(cè)條中，15min后觀察結(jié)果，陽(yáng)性說(shuō)明為結(jié)核分枝桿菌。同時(shí)用Gen-Probe分子生物學(xué)診斷的AccuProbe探針檢測(cè)試劑盒，完成結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)和鑒定。

1.3.5 藥敏結(jié)果判讀聯(lián)合藥敏SM、INH、RFP和EMB 4種藥物共用1個(gè)生長(zhǎng)對(duì)照管，對(duì)照管作1: 100稀釋。PZA藥敏采用PZA專用培養(yǎng)管，對(duì)照管作1:10稀釋。當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照管的生長(zhǎng)單位(GU)≥400時(shí)，評(píng)價(jià)含藥物的培養(yǎng)管，如果含藥物的培養(yǎng)管GU≥100，則結(jié)果判為耐藥，如果GU＜100，則結(jié)果判為敏感。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核菌3種實(shí)驗(yàn)診斷方法的平均時(shí)間、陽(yáng)性率和污染率的比較，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核菌3種實(shí)驗(yàn)診斷方法的平均時(shí)間、陽(yáng)性率和污染率比較

2.2 106株結(jié)核菌藥敏結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 106株結(jié)核菌藥敏結(jié)果

3 討論

分枝桿菌是一類(lèi)抗酸陽(yáng)性的細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌，有時(shí)呈分枝狀。根據(jù)致病性的不同，分為結(jié)核分枝桿菌群和非結(jié)核分枝桿菌群。結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌，能夠?qū)е逻M(jìn)行性疾病和無(wú)癥狀的潛伏感染。本菌可侵犯全身各組織器官，以肺部感染最為多見(jiàn)。目前檢測(cè)分枝桿菌的方法有涂片鏡檢法、羅氏固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法和PCR檢測(cè)法等。其中，分枝桿菌的涂片鏡檢與培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

涂片鏡檢法方法快速簡(jiǎn)單，但敏感性較低，痰標(biāo)本含菌量達(dá)104/ml方能檢出[4]。從表1可以看出，涂片鏡檢雖然所用時(shí)間最短，但陽(yáng)性率僅達(dá)到2%，明顯低于固體培養(yǎng)的7.1%和液體培養(yǎng)的9.2%。涂片鏡檢法的陽(yáng)性率與標(biāo)本的質(zhì)量密切相關(guān)，且一般要求連續(xù)送檢3d，以提高檢出率。另外，涂片鏡檢法無(wú)法開(kāi)展菌型鑒定及藥敏試驗(yàn)，因此有很大的局限性。

由于分枝桿菌生長(zhǎng)速度緩慢，18h分裂一次，故分枝桿菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。分枝桿菌的培養(yǎng)基有改良的羅氏固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。從表1可以看出，液體培養(yǎng)的時(shí)間比固體培養(yǎng)的時(shí)間明顯縮短，但液體培養(yǎng)需要昂貴的儀器設(shè)備，基層醫(yī)院很難開(kāi)展。液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)，但污染率相對(duì)較高，這可能與前處理液中的氫氧化鈉濃度有關(guān)。

固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出分枝桿菌后，必須對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步的菌型鑒定。目前我院采用的是簡(jiǎn)便快速的膠體金法，同時(shí)用通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證的Gen-Probe分子生物學(xué)診斷的AccuProbe探針檢測(cè)法進(jìn)行驗(yàn)證。283株分枝桿菌的菌型鑒定結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌占152株，非結(jié)核分枝桿菌占131株。膠體金法和AccuProbe探針檢測(cè)法的符合率為100%。膠體金法方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，可以作為結(jié)核菌菌型鑒定的首選方法。

經(jīng)膠體金法和AccuProbe探針檢測(cè)法的聯(lián)合檢測(cè)，我院對(duì)檢出的152株結(jié)核分枝桿菌中的106株(剔除了重復(fù)菌株)進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：106株結(jié)核分枝桿菌中，對(duì)5種抗結(jié)核一線藥物全敏感的有74株，占69.8%；耐藥的有32株，占30.2%，低于國(guó)家調(diào)查公布的46%的全國(guó)平均耐藥水平[5]。其中耐PZA的比例最高，達(dá)到23.6%，高于昆明蘇俊華等人報(bào)告的10.1%[6]。其次是INH,占12.3%，EMB的敏感性最好，耐藥率為0。對(duì)MDRTB也做了統(tǒng)計(jì)，僅占2.8%，比例較低，這可能與受檢群體為疑似結(jié)核的出國(guó)體檢人員有關(guān)，這些患者一般都是首次發(fā)現(xiàn)，大部分還沒(méi)有經(jīng)過(guò)治療。

通過(guò)對(duì)疑似結(jié)核的出國(guó)體檢人員的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，我們對(duì)這一群體的陽(yáng)性檢出率及藥敏耐藥率等有了初步的了解，積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，這對(duì)出國(guó)體檢人員這一群體結(jié)核病的檢出與防治具有重要意義。

[1]Global Tuberculosis control:WHO report 2011[EB/OL].2011.http:// www.who.int/tb/publications/global-report/en.

[2]Rosenkrands I,Aagaard C,Weldingh K,et al.Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis[J].Tuberculosis,2008,88(4):335-343.

[3]張思潮,邱志紅,陸惠勤.不同痰液標(biāo)本肺結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果比較[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,20(1):59．

[4]熊禮寬.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003：92-135.

[5]葉鶯,嚴(yán)延生.耐多藥結(jié)核病的流行概況[J].疾病控制雜志,2008,13 (1):63-65.

[6]蘇俊華,梁桂亮,保凌.昆明地區(qū)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本培養(yǎng)檢測(cè)及耐藥情況分析[J].中國(guó)防澇雜志,2012,34(1):32-35.

Evaluation of three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analysis of drug resistance in isolates

LI Ning,WU Yanan,Hu Xinlan,et al.Department of Clinical Laboratory,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China

Objective To compare three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analyze the distribution and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolated from personnel going abroad.Methods The results of 3090 samples from 1030 personnel going abroad with suspected tuberculosis in Fujian provincial hospital from 2010 to 2012 were collected and analyzed,which were detected by smear-microscopy method,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method.The results of the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis were analyzed too.Results Among the smear-microscopy,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method,the detection times of them were 2 hours,21.4 days and 11.2 days respectively;the positive rates of them were 2.0%,7.1%and 9.2%respectively,the contamination rates of Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method were 2.1%and 4.3%respectively.In total 106 strains of Mycobacterium tuberculosis,the number of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide,Isoniazid,Streptomycin and Rifampin were 25,13,9 and 4,respectively;all strains were sensitive to Ethambutol;and 74 strains were sensitive to all five drugs.Conclusions Among three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis,the MGIT 960 liquid culture method is the best,which spends the least time and has the highest positive rate.Among five mainly used anti-tuberculosis first-line drugs,the top two levels of drug resistance to Mycobacterium tuberculosis were Pyrazinamide and Isoniazid.

Tuberculosis;Mycobacterium;Detection;Evaluation;Drug resistance

R446.5，Q939.92，R378.91+1，R52

A

1674-1129(2013)03-0214-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.005

李寧，女，1974年12月出生，畢業(yè)于福建醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系，學(xué)士學(xué)位。主管技師，從事臨床微生物的檢驗(yàn)與研究。