郭 婷，張宇昊,2，馬 良,3,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶 400716)

納米抗體的特性及其應(yīng)用研究進(jìn)展

郭 婷1，張宇昊1,2，馬 良1,3,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶 400716)

納米抗體與傳統(tǒng)IgG抗體相比，具有分子質(zhì)量小、更容易被生產(chǎn)、穩(wěn)定性好、抗原結(jié)合力高等特點(diǎn)，目前在醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等很多方面展開了積極有效的研究和應(yīng)用。本文重點(diǎn)就納米抗體的結(jié)構(gòu)、特性和在食品科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述和分析，并對(duì)納米抗體在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

納米抗體；特性；食品；應(yīng)用

基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫分析技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，近些年發(fā)展迅猛，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前免疫分析法主要利用單克隆抗體、多克隆抗體等來實(shí)現(xiàn)真菌毒素、農(nóng)獸藥殘留、食品添加劑、非法添加物等各種食品危害物的檢測(cè)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，容易純化、標(biāo)記。但其制備復(fù)雜、價(jià)格較昂貴[1-2]，不能進(jìn)行沉淀和凝膠反應(yīng)[1-3]，應(yīng)用范圍受到一定限制。多克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度大，與抗體的親和力和靈敏度相對(duì)較高，但特異性相對(duì)較低，在檢測(cè)中很容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。目前，小分子功能抗體作為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]，主要有Fab片段(L和Fd)、Fv(VH和VL)、ScFv、納米抗體等。與其他小分子功能抗體相比，納米抗體的親和力高、穩(wěn)定性好，更易制備成穩(wěn)定的融合子，有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

生物學(xué)家Ward在1989年分離檢測(cè)駱駝血清中抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)，駱駝血液中除常規(guī)的四鏈抗體外，還有一些僅含重鏈的抗體。1993年，Hamers-Casterman等[4]研究表明，駱駝抗體天然缺失輕鏈，只含有重鏈，因此又稱重鏈抗體(heavy chain antibodies，HCAbs)。另有研究者[5]發(fā)現(xiàn)，駱駝抗體中還缺少CH1?？寺≈劓溈贵w的可變區(qū)得到只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)。VHH晶體直徑2.5nm，長(zhǎng)4nm，因此又稱為納米抗體(nanobody，Nb)[6-7]，是自然存在的可與抗原結(jié)合的最小片段。納米粒子具有的顆粒尺寸小、比表面積大、表面能高等特點(diǎn)，以及表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)[8]使得納米抗體在諸多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)抗體。納米抗體在疾病的檢測(cè)和治療方面有顯著應(yīng)用成果[9-11]，而在食品領(lǐng)域的應(yīng)用處于起步階段，今后將在食品工業(yè)及檢測(cè)方面發(fā)揮巨大的作用。本文主要針對(duì)納米抗體的特性和在食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行綜述和分析，對(duì)納米抗體在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 納米抗體的結(jié)構(gòu)

圖1 抗體結(jié)構(gòu)模式圖[7]Fig.1 Antibody structure[7]

納米抗體(圖1C)一般結(jié)構(gòu)呈橢圓形，體積很小，分子質(zhì)量為單克隆抗體的1/10(15kD)[12]，與普通抗體(圖1A)相比，化學(xué)性質(zhì)更加活潑，具有納物質(zhì)的量級(jí)親和力，能更有效地與抗原縫隙結(jié)合[13]。納米抗體的基因組中存在恒定區(qū)(constant region of heavy chain 1，CH1)，它是輕鏈錨定的部位，但在mRNA形成中被剪切掉，所以納米抗體缺乏輕鏈[5]。納米抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)是2個(gè)β片層形成支架，3個(gè)高變區(qū)聚集在一側(cè)參與抗原識(shí)別。與駱駝的重鏈抗體相比，納米抗體僅由重鏈可變區(qū)組成。而駱駝的重鏈抗體(圖1B)含有一個(gè)鉸鏈區(qū)，兩個(gè)恒定區(qū)(CH2和CH3)和獨(dú)特的重鏈可變區(qū)(VHH)。

駱駝源VHH(即Nb)和人體VH的基因同源性達(dá)到80%～90%[14]，結(jié)構(gòu)十分相似，都包含3個(gè)高變區(qū)(hypervariable region，HVR)和4個(gè)骨架區(qū)(framework region，F(xiàn)R)。通過比較發(fā)現(xiàn)，駱駝VHH 與人體VH之間存在微小但不容忽視的區(qū)別，主要包含兩方面：1)它們的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)不同。VHH的CDR1和CDR3比VH更長(zhǎng)。VHH的CDR3長(zhǎng)度為16～18個(gè)氨基酸，而人和小鼠VH的平均長(zhǎng)度分別只有14和12個(gè)氨基酸[15-17]。2)它們的區(qū)別在于FR2中的氨基酸[18]。普通抗體的FR2中V37、G44、L45和W47這4個(gè)氨基酸殘基是疏水性殘基，在進(jìn)化中是相當(dāng)保守的[15]。而VHH中，它們突變?yōu)橛H水性的氨基酸殘基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性[15](圖2)。因此，將人源抗體VH結(jié)構(gòu)域FR2中的一些氨基酸進(jìn)行VHH特征性改造，可以獲得穩(wěn)定性好、溶解性好，并且保持原有抗體特異性和親和力的VH 抗體[19]。目前，人源化已經(jīng)取得成功[14]。

圖2 人源VH和駱駝源VHH基因序列[7]Fig.2 Gene sequences of human VH and camel VHH[7]

2 納米抗體的特性

2.1 理化性

納米抗體在許多理化性質(zhì)方面具有三方面的明顯優(yōu)勢(shì)：1)Nb溶解性高。由于Nb的FR2中一些親水性氨基酸取代疏水性氨基酸，使Nb的溶解性增加，從而提高作為藥物的利用率。2)Nb抗熱性強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，在37℃放置1周后Nb仍能保持80%以上的生物活性，這使其在室溫條件下更易于使用和保存[20-21]。然而單鏈抗體的穩(wěn)定性差，常常顯示聚集傾向，在37℃產(chǎn)生聚集現(xiàn)象[22]，大大限制了其應(yīng)用。Nb內(nèi)部存在二硫鍵是其抗熱性強(qiáng)的主要原因[23]。3) Nb易復(fù)性。在高于90℃的環(huán)境中長(zhǎng)期放置，Nb仍能重新獲得生物活性[24-25]。同時(shí),Nb在強(qiáng)變性劑的條件下也表現(xiàn)出較高的耐受性[26]。其他抗體則發(fā)生不可逆的熱聚合[18]。2.2 抗原結(jié)合性

納米抗體有較高的抗原結(jié)合力和目標(biāo)親和力。Nb包含了骨架區(qū)的氨基酸殘基，在一定程度上彌補(bǔ)缺失輕鏈造成的抗原結(jié)合力低的不足；同時(shí)Nb的CDR3較長(zhǎng)，形成穩(wěn)定的凸形結(jié)構(gòu)，可深入抗原內(nèi)部更好地結(jié)合抗原。普通抗體只能識(shí)別抗原表面的位點(diǎn)。因此Nb的抗原結(jié)合能力更廣泛，不僅可結(jié)合小分子半抗原和肽，還可結(jié)合大分子蛋白和病毒，甚至當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)被深入包埋時(shí)，小分子的Nb也可對(duì)其進(jìn)行表位識(shí)別[27]。

2.3 免疫原性

納米抗體對(duì)人體的免疫原性弱，生物相容性好。免疫原性是指能夠刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。免疫原性與分子大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)等有關(guān)，分子質(zhì)量越小免疫原性越小。Nb分子質(zhì)量很小，只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，缺少Fc段，從而避免了Fc段引起的補(bǔ)體反應(yīng)，對(duì)人體的免疫原性很低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，納米抗體未引起任何體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[28]。因此，可通過帶有人VH FR2烙印的納米抗體來獲得非免疫原性納米抗體。但有研究表明，納米抗體作為藥物長(zhǎng)期反復(fù)使用會(huì)增加免疫原性，影響治療[29]。

2.4 穿透性

相對(duì)單克隆抗體顯影劑組織穿透力差、不易清除的不足[30]，納米抗體的組織穿透能力很強(qiáng)，可以進(jìn)入致密的組織，并且多余未結(jié)合的納米抗體能夠被快速清除，有利于疾病的診斷。Cortez-Retamozo等[31]制備的納米抗體顯影劑穿透性好、親和力高、腫瘤組織的顯像效果好，并且對(duì)正常組織幾乎沒有損傷。近期報(bào)道[32]，納米抗體用于分子顯像會(huì)強(qiáng)烈地滯留在腎臟中，影響胰臟附近檢測(cè)分子信號(hào)的靈敏度。用18F標(biāo)記的納米抗體的腎臟滯留量最小(＜7%)[33]。另有研究[34]表明，納米抗體能夠有效地穿透血腦屏障，為腦部供藥提供新方法。

2.5 生產(chǎn)性

納米抗體的分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能被單個(gè)基因編碼，利用基因工程能在酵母菌、大腸桿菌等微生物中大量表達(dá)。納米抗體相對(duì)價(jià)格低廉、可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，易于普及和應(yīng)用。涂追等[35]利用半巢式PCR法構(gòu)建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫，文庫的多樣性較好，可以用于后續(xù)淘汰。Ablynx公司表示，他們將酵母反應(yīng)器釀造納米抗體的產(chǎn)量提高，達(dá)到0.5g/L的產(chǎn)量[31]。

3 納米抗體在食品科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

納米抗體具有普通抗體沒有的獨(dú)特性質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行基因改造，使其攜帶特定的結(jié)構(gòu)，在疾病的診斷與治療上比其他抗體更有優(yōu)勢(shì)，近幾年在這些方面的應(yīng)用報(bào)道逐年增多。而納米抗體在食品科學(xué)領(lǐng)域，如食品毒理學(xué)研究、食品分析檢測(cè)等方面的研究和應(yīng)用較晚，但已成為新的研究熱點(diǎn)。尤其是近兩年涌現(xiàn)出不少研究和應(yīng)用成果，顯示出納米抗體在該領(lǐng)域應(yīng)用的巨大潛力。

3.1 食物中毒的解毒

食品毒理學(xué)研究表明，Nb能與細(xì)菌結(jié)合，抑制細(xì)菌產(chǎn)酶的活性，從而起到一定的治療作用。此外，Nb還可以中和細(xì)菌毒素、蛇蝎毒素。Hmila等[36]篩選出抗蝎子毒素Aa2hI’的Nb，這種抗體可以高效中和AahI’毒素，用于解毒。

3.2 食品污染物的脫毒

研究表明，應(yīng)用納米粒子的表面效應(yīng)可對(duì)飼料中AFT進(jìn)行脫毒處理，能有效降低AFT的危害[37]。納米抗體是一種納米粒子，具有納米粒子的三大效應(yīng)，即表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、宏觀隧道量子效應(yīng)。因此可以運(yùn)用納米抗體的表面效應(yīng)進(jìn)行食品及原料中污染物的脫毒研究。

3.3 食品檢測(cè)

納米抗體屬于新型抗體，在國內(nèi)外食品檢測(cè)方面研究和應(yīng)用相對(duì)較晚，尤其是國內(nèi)相關(guān)的研究和應(yīng)用報(bào)道較少。但隨著納米抗體等小分子功能抗體自身優(yōu)勢(shì)不斷體現(xiàn)，近些年研究逐漸增多，2010—2011年國內(nèi)相關(guān)研究機(jī)構(gòu)相繼報(bào)道了一批有關(guān)小分子功能抗體的研究結(jié)果，充分顯示了納米抗體等小分子功能抗體巨大的應(yīng)用前景。

據(jù)報(bào)道[38-39]江南大學(xué)制備出抗黃曲霉毒素B1的小分子功能抗體ScFv片段，利用該ScFv片段檢測(cè)醬油中的黃曲霉毒素B1

[40]。管笛等[41]制備出AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的無毒替代物F(ab')片段，也屬于小分子功能抗體，并將其用于花生樣品檢測(cè)。另有學(xué)者制備出各種小分子功能抗體，如抗克倫特羅ScFv片段[42-43]、抗有機(jī)磷ScFv片段[44]、抗氨基甲酸酯ScFv片段[45]等，這些片段可用于建立針對(duì)小分子物質(zhì)的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)，具有分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。然而，有研究[22,46]發(fā)現(xiàn)上述片段仍存在穩(wěn)定性相對(duì)較差、親和性較低等缺點(diǎn)，限制了其在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用。

2009年，Kirchhofer等[47]篩選出能調(diào)節(jié)綠色熒光蛋白(GFP)構(gòu)象及光譜性質(zhì)的納米抗體。名為Enhancer的納米抗體與GFP結(jié)合，使熒光效果增強(qiáng)5倍；而名為Minimizer的納米抗體使蛋白的某特定區(qū)遠(yuǎn)離發(fā)光區(qū)，從而使熒光效果降低5倍。該研究表明，Nb可以在體內(nèi)或體外控制蛋白構(gòu)象。目前，研究人員正在篩選與其他熒光蛋白特異的納米抗體。利用納米抗體增強(qiáng)熒光強(qiáng)度來提高食品檢測(cè)的靈敏性，有重要的現(xiàn)實(shí)意義。另外，Muyldermans等[8]重組Nb，將其作為生物傳感器的探針。在食品工業(yè)中可利用探針能與待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的性質(zhì)來檢測(cè)食品中的有毒有害物質(zhì)。

4 結(jié) 語

納米抗體的穩(wěn)定性好、親和力較高，克服了小分子功能抗體的缺點(diǎn)，同時(shí)又具有分子質(zhì)量小、免疫原性弱、組織穿透力強(qiáng)等單克隆抗體、多克隆抗體不具備的優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)用于食品檢測(cè)、疾病治療等方面。在食品免疫及相關(guān)檢測(cè)方面還有待于進(jìn)一步深入地研究和應(yīng)用，經(jīng)過綜述與分析，在以下3個(gè)領(lǐng)域極具開發(fā)和研究潛力：1)利用細(xì)胞工程技術(shù)、基因工程技術(shù)等新型技術(shù)，構(gòu)建基于納米抗體的雙功能抗體，與兩種性質(zhì)不同的抗原發(fā)生結(jié)合，在多殘留檢測(cè)、天然噬菌體單域重鏈抗體文庫構(gòu)建等方面發(fā)揮重要的作用。2)利用納米抗體對(duì)組織穿透力強(qiáng)和對(duì)靶位點(diǎn)的親和力高的特點(diǎn)，進(jìn)入致密組織，檢測(cè)被深入包埋的物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)肉制品、蛋制品、乳制品、餅粕飼料等各種復(fù)雜基質(zhì)食品中非法添加物和小分子污染物等的高靈敏度檢測(cè)。3)利用納米抗體控制熒光蛋白的熒光特性，選擇性增強(qiáng)或猝滅熒光，用熒光探針技術(shù)提高毒素、農(nóng)獸藥殘留物等物質(zhì)的分析檢測(cè)靈敏度。

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Properties and Application Prospects of Nano-Antibody in Food Industry

GUO Ting1，ZHANG Yu-hao1,2，MA Liang1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing, Chongqing 400716, China；3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservations (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400716, China)

Compared with IgG antibodies, nano-antibodies have the properties with smaller size, easier production, high stability and excellent aff i nity. Currently, nano-antibodies are developed and applied in the fi eld of medical and food science. In this paper, the structure, properties and applications of nano-antibodies in food industry have been reviewed and analyzed, which will provide extensive application prospect in food detection.

nano-antibody；property；food；application

TS207.3

A

1002-6630(2013)03-0294-04

2011-12-28

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z427)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2011B001)

郭婷(1988—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：heavencandy@163.com

*通信作者：馬良(1979—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品檢測(cè)技術(shù)。E-mail：zhyhml@163.com