鄧 昆，劉 莉，陳彩宇，陳 墾，王 微，周永巧，何多芬，曾春雨△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科／重慶心血管病研究所，重慶400042；2.77263部隊(duì)醫(yī)院，云南大理671000）

原發(fā)性高血壓（esesntalihypertension，EH）是冠心病、糖尿病腎病以及腦梗死等的重要危險(xiǎn)因素。EH的發(fā)生和遺傳因素密切相關(guān)，與EH基因連鎖的G蛋白偶聯(lián)受體激酶4（GRK4）也因此受到越來越多的關(guān)注。GRK4是GRKs的一種，在GRKs的幾個(gè)亞型中，只有GRK4的改變先于高血壓的發(fā)生而發(fā)生［1-2］，其變異體A142V和EH的發(fā)生密切相關(guān)［3］。腎素血管緊張素（RAS）系統(tǒng)激活參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是整個(gè)RAS系統(tǒng)最重要的因子之一，血管緊張素Ⅱ1型（AT1）受體是AngⅡ的主要作用受體，其介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VMSCs）增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、術(shù)后血管再狹窄共同的病理基礎(chǔ)［4］。既往的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GRK4γA142V基因的小鼠GRK4升高的同時(shí)血壓明顯升高［1］，Yatabe等［5］發(fā)現(xiàn)在腎臟組織 AT1受體伴隨 GRK4的改變而發(fā)生改變，本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn)人和大鼠的血管上有GRK4的表達(dá)，作者推測血管組織GRK4對AT1受體也有重要的調(diào)控作用。因此，本研究以轉(zhuǎn)染hGRK4γWT和hGRK4γA142V的A10細(xì)胞為研究對象，檢測這兩種細(xì)胞中AT1受體的改變和細(xì)胞增殖的變化，以探索hGRK4γA142V如何影響RAS系統(tǒng)而引起VSMCs異常增殖導(dǎo)致EH的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株（A10），hGRK4γWT和hGRK4γA142V質(zhì)粒由美國馬里蘭大學(xué)Dr Pedro A Jose實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，DMEM高糖型培養(yǎng)基，F(xiàn)BS胎牛血清購自美國GIBCO公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；GRK4活性測定試劑盒購自上海杰美公司；兔抗AT1R、兔抗β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司；磷酸化蘇氨酸抗體購自美國cell signaling technology公司；［3H］胸腺嘧啶試劑盒購自北京原子能研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體的構(gòu)建、病毒的生產(chǎn)包裝及轉(zhuǎn)染 將hGRK4γWT質(zhì)粒、hGRK4γA142V質(zhì)粒和綠色熒光蛋白（EGFP）基因克隆至慢病毒表達(dá)載體，利用lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锱c包含hGRK4γWT、hGRK4γA142V的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至病毒生產(chǎn)細(xì)胞系293TN，48h后收集上清液，使用0.45μm濾膜過濾上清液，由此包裝、生產(chǎn)出攜帶GRK4γWT、GRK4γA142V基因的重組慢病毒 （Lv-GRK4γWT-EGFP 和 Lv-GRK4γA142V-EGFP），收集上清液，以MOI值為10感染A10細(xì)胞。

1.2.2 熒光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP表達(dá) hGRK4γWT和hGRK4γA142V細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板中（內(nèi)置蓋玻片），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第3天，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3次，取細(xì)胞爬片置熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫印跡檢測AT1受體 常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。將50μg變性好的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉1h，與GRK4抗體，AT1受體抗體（1∶400）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10min，羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗滌3次×10min，利用增敏化學(xué)發(fā)光法，經(jīng)X線片曝光、顯影、定影。結(jié)果經(jīng)光密度面積分析，與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的比值作為相對濃度。

1.2.4 分光光度法檢測GRK4活性 提取細(xì)胞總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。65μL緩沖液，10μL酶促液，10 μL反應(yīng)液，10μL底物液于30℃培養(yǎng)箱里靜置3min，加入50 μg蛋白，陰性對照加入5μL陰性液作為背景對照，用分光光度法測定，以每微克總蛋白中GRK4每分鐘NADH轉(zhuǎn)化為NAD的量表示。

1.2.5 ［3H］胸腺嘧啶的摻入試驗(yàn)將hGRK4γWT 和hGRK4γA142V細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)／mL，按1mL／孔接種于24孔培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后換等量的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)2h，然后向每孔中加入［3H］胸腺嘧啶0.3mCi繼續(xù)培養(yǎng)6h，吸去含游離［3H］胸腺嘧啶的培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，真空抽濾法將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾膜，依次用PBS、10%三氯乙酸及無水乙醇沖洗，抽干后于80℃、30min烤干，置液閃杯中，加入5mL液體閃爍液，靜置平衡過夜，在液閃儀上計(jì)數(shù)每分鐘的值，以3×104細(xì)胞表示［3H］胸腺嘧啶的摻入率［4，6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，兩組以上的比較采用ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hGRK4γWT和hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的建立及蛋白鑒定 構(gòu)建了野生型GRK4wild-IRES2-EGFP表達(dá)載體和突變體GRK4A142V-IRES2-EGFP表達(dá)載體，慢病毒以MOI值為10感染A10細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察，兩種細(xì)胞均可見90%細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)EGFP，呈綠色熒光，提示病毒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，攜帶基因的蛋白表達(dá)。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光（×200）

2.2 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞GRK4活性的改變 結(jié)果顯示，hGRK4γA142V細(xì)胞的GRK4酶活性顯著升高。見圖2。

圖2 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞GRK4活性的改變

2.3 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞AT1受體的改變 免疫印跡顯示A10細(xì)胞轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V基因后，AT1受體表達(dá)顯著升高。見圖3。

圖3 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞AT1受體表達(dá)的改變

2.4 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞GRK4和AT1受體共連接的改變 免疫沉淀顯示，GRK4和AT1受體間存在共連接作用，hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞GRK4和AT1受體的共連接作用明顯減弱，這種共連接的改變可能參與了GRK4對AT1受體的調(diào)節(jié)作用。見圖4。

圖4 hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞GRK4和AT1共連接的改變

2.5 AngⅡ刺激轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞增殖效應(yīng)的改變 采用［3H］胸腺嘧啶摻入法測定細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示AngⅡ刺激hGRK4γA142V細(xì)胞引起細(xì)胞增殖幅度明顯高于刺激hGRK4γWT細(xì)胞，見圖5。

圖5 AngⅡ刺激hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因細(xì)胞引起增殖效應(yīng)改變

3 討 論

RAS在調(diào)節(jié)血管張力及鈉水平衡方面發(fā)揮了重要作用。AngⅡ作為RAS系統(tǒng)中最主要的生物活性物質(zhì)，其和AT1受體結(jié)合后介導(dǎo)了細(xì)胞增殖、腎近曲小管細(xì)胞尿鈉轉(zhuǎn)運(yùn)，與AT2受體結(jié)合則發(fā)揮相反的作用。高血壓狀態(tài)下AT1受體的功能增加，其發(fā)生的原因目前尚不明了。GRKs是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，共7個(gè)亞型，其主要生理功能是磷酸化GPCR，使GPCR介導(dǎo)的信號通路失敏，在這7個(gè)亞型中只有GRK4的改變先于高血壓的發(fā)生。GRK4基因所在的染色體部位（4p16.3）與EH的發(fā)生關(guān)系密切，其基因變異體也和EH的發(fā)生密切相關(guān)［6］。人的 GRK4有α、β、γ、δ4種異構(gòu)體，γ異構(gòu)體的3個(gè)突變位點(diǎn)A142V、A486V、R65L可以引起GRK4活性升高和EH密切相關(guān)，所以γ亞基成為本研究關(guān)注的焦點(diǎn)［7］。Jose等［8］發(fā)現(xiàn)在3個(gè)突變體中只有A142V轉(zhuǎn)基因小鼠在正常鹽飲食的情況下可以發(fā)生高血壓，他們還發(fā)現(xiàn)在攜帶A142V突變基因的日本高血壓患者中，服用血管緊張素受體阻斷劑（ARB），血壓出現(xiàn)顯著性降低，A142V轉(zhuǎn)基因小鼠服用ARB后血壓恢復(fù)正常。這提示GRK4γA142V突變引起的血壓升高和RAS系統(tǒng)及AT1受體有密切聯(lián)系。

既往研究發(fā)現(xiàn)人的GRK4存在于睪丸、腎臟和腦組織中［9］，而本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)VSMCs中有GRK4表達(dá)。在腎臟組織GRK4和AT1受體有密切關(guān)系，那么在血管組織中，GRK4是否也調(diào)節(jié)AT1受體的表達(dá)及其介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖。本研究轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V到 A10細(xì)胞中，觀察到GRK4活性顯著升高，這種現(xiàn)象證實(shí)hGRK4γA142V可以使GRK4的活性增強(qiáng)。AT1受體作為GPCRs的一種，Zheng等［10］發(fā)現(xiàn)hGRK4γA142V轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟AT1受體表達(dá)升高，在血管中，GRK4是否具有相同的效應(yīng)，本研究結(jié)果顯示hGRK4γA142V細(xì)胞中AT1受體的表達(dá)顯著升高。推測這種活性的增強(qiáng)引起的AT1受體表達(dá)的改變參與了高血壓的發(fā)生、發(fā)展。作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V可導(dǎo)致GRK4和AT1受體的共連接降低，推測GRK4和AT1受體的共連接程度減少導(dǎo)致GRK4和AT1受體偶聯(lián)減少，而這種偶聯(lián)的減少可能與AT1受體磷酸化的改變相關(guān)。

據(jù)以往報(bào)道，AT1受體具有自發(fā)活性，當(dāng)AngⅡ刺激時(shí)AT1受體的活性明顯增強(qiáng)［11-12］，在血管中AT1受體介導(dǎo)的VSMCs的異常增殖是血管壁增厚和硬化的主要病理、生理基礎(chǔ)［13］。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ刺激后轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V細(xì)胞的增殖效應(yīng)明顯高于轉(zhuǎn)染hGRK4γWT細(xì)胞，在沒有AngⅡ刺激的狀態(tài)下轉(zhuǎn)染hGRK4γA142V細(xì)胞的增殖效應(yīng)仍然明顯高于轉(zhuǎn)染hGRK4γWT細(xì)胞。

綜上所述，hGRK4γA142V通過影響的VSMCs AT1受體表達(dá)，從而影響AT1受體介導(dǎo)的VSMCs增殖，在心血管系統(tǒng)疾病的病理、生理過程中具有重要意義。

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