張志菲 劉月華

[摘要]目的：通過建立正畸牙根吸收動(dòng)物模型，檢測(cè)牙根面及根周組織中骨型膠原酶（MMP-13）的分布和表達(dá)，研究多西環(huán)素（DOXY）對(duì)根吸收及骨型膠原酶表達(dá)的影響。方法：選用SD大鼠36只建立正畸牙移動(dòng)根吸收的動(dòng)物模型，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、注射DOXY對(duì)照組、正常牙加力組、注射DOXY加力組。在加力的0天、7天、10天、14天分別處死各組大鼠。并取相應(yīng)時(shí)段的標(biāo)本制作組織切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)分析各組中骨型膠原酶（MMP-13）在第一磨牙根吸收組織中的定位表達(dá)，檢測(cè)多西環(huán)素對(duì)根周組織內(nèi)骨型膠原酶表達(dá)及分布的影響。用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)定量比較上述試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果：在多西環(huán)素的影響下，在第7天和第10天給藥受力組的MMP-13 的陽性表達(dá)低于受力不給藥組。給藥受力組MMP-13的陽性表達(dá)在第10天更低（P<0.01）。兩實(shí)驗(yàn)組MMP-13 的陽性表達(dá)都在第10天到達(dá)峰值后第14天趨于平穩(wěn)。結(jié)論：多西環(huán)素可能作為骨型膠原酶的抑制劑對(duì)破骨細(xì)胞的募集及牙根吸收有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]牙根吸收；多西環(huán)素；正畸牙齒移動(dòng)；骨型膠原酶

[中圖分類號(hào)]R783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2014）09-0734-05

An experimental study on expression of collagenase-3 during orthodontic tooth movement in rats with doxycycline administration

ZHANG Zhi-fei1,LIU Yue-hua2

(1.Department of Stomatology, Luwan Branch, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200020,China;2.Department of Orthodontics, School of Stomatology,Tongji University, Shanghai 200072, China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and the localization of MMP-13 in root-resorbing tissue during experimental tooth movement with doxycycline(DC) administration, to elucidate the protein changes and mechanism of root resorption induced by orthodontic tooth movement. All of these could give an evidence which maybe used regulate orthodontic tooth movement more efficiently.MethodsAnimal models of experimental orthodontic tooth movement in Sprague-Dawley rats were established. 36 male rats were randomly assigned to four groups.Nine animals served as untreated controls. Nine animals were only administered DC for 7 days, by means of injection on rat's back subcutaneously daily.In 18 animals the maxillary first molar was moved mesially by a continuous and constant reciprocal force of 50g from Sentalloy? closed-coil springs. In 9 of these animals DC was administered at the time of appliance insertion and throughout the experiment.The animals were sacrificed 7,10 or 14 days after force application. An area including the mesial aspect of the mesial root and the adjacent interradicular alveolar bone was histomorphometrically evaluated.The expression and localization of MMP-13 were examined by immunohistochemical technology. Computer image analysis was performed to evaluate all of these results.ResultsThe expression of MMP-13 presents a peak at day 10 and decreased at day 14. The doxy-ortho group demonstrated significantly fewer MMP-13- positive cells on the root surface than the ortho group at day 7 and day 10.ConclusionAs an effective collagenase inhibitor, DC may have an inhibitory effect on the recruitment of osteoclasts and orthodontically induced resorptive activity.

Key words:root resorption;doxycycline;orthodontic tooth movement;MMP-13

一直以來，正畸牙齒移動(dòng)根吸收的生物學(xué)機(jī)制深受學(xué)者們關(guān)注。研究顯示，根吸收過程與骨吸收類似，而骨吸收包括兩個(gè)過程：礦物質(zhì)的溶解和有機(jī)質(zhì)的降解，有機(jī)質(zhì)主要由膠原構(gòu)成，而膠原的降解主要通過蛋白酶，特別是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和溶酶體酶完成。已證實(shí)MMPs幾乎在機(jī)體各種組織的發(fā)育和修復(fù)、炎癥反應(yīng)等過程發(fā)揮著重要作用。其中早有研究顯示在乳牙的生理性根吸收過程中，MMPs起到了關(guān)鍵作用[1]。MMP-13亦稱骨型膠原酶、膠原酶-3，與膠原酶-1（MMP-1）、膠原酶-2（MMP-8）同屬M(fèi)MPs家族中的膠原酶組 。Hiroaki Nakamura等的研究顯示，MMP-13在骨基質(zhì)膠原的降解中起到了重要作用[2]。MMP-13在正畸移動(dòng)牙根吸收過程中的膠原降解中是否也扮演著同樣重要的角色呢？四環(huán)素類藥物，是一種廣譜抗生素，它的化學(xué)修飾同類物已經(jīng)被用于臨床輔助治療牙周病。有研究顯示在牙體牙髓治療中局部應(yīng)用多西環(huán)素能抑制炎性根吸收以及牙外傷導(dǎo)致的炎性牙槽骨吸收[3]，多西環(huán)素對(duì)大鼠正畸移動(dòng)牙根吸收組織內(nèi)膠原酶的活性是否也有抑制作用呢？本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠建立正畸牙齒移動(dòng)根吸收模型，使用免疫組化染色法觀察和比較在多西環(huán)素影響下，不同加力時(shí)間組根吸收組織中MMP-13的表達(dá)與分布的變化。

1材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立：選取36只健康雄性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），體重220g左右，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、注射DOXY對(duì)照組、正常牙加力組、注射DOXY 加力組，每組9只。各受力組均使用Sentalloy R關(guān)閉彈簧（50g力，GAC，NEWYORK，NY，USA）使上頜一側(cè)第一磨牙在50g持續(xù)恒定力值的作用下向近中移動(dòng)。各給藥組均每天經(jīng)皮下給以鹽酸多西環(huán)素（上海天田科技有限公司），每天給藥的劑量是0.24mg/天，（1.2mg/kg體重/天），在實(shí)驗(yàn)的第7天處死全部對(duì)照組大鼠，加力組大鼠則于第7天、10天、14天分別處死各組大鼠，3只/每組/每次。并取相應(yīng)時(shí)段的受力側(cè)第一磨牙及其周圍組織標(biāo)本制作組織切片，進(jìn)行組織學(xué)分析。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，采用自然光源飼養(yǎng)條件。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠各組標(biāo)本制備：分別于第7、10、14天過量麻藥處死各組大鼠，取實(shí)驗(yàn)大鼠上頜骨實(shí)驗(yàn)側(cè)磨牙及其周圍組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后用蒸餾水漂洗1分鐘，放入乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣劑中，4℃下，脫鈣6～8周，去除多余組織塊，保留磨牙及其周圍組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸漬包埋。將標(biāo)本按牙齒移動(dòng)近遠(yuǎn)中矢狀方向通過牙齒中央窩脊髓腔的中軸層面連續(xù)切片6張，各位5μm厚，裱于經(jīng)氨丙基三乙氧基硅烷（APES）處理過的玻片上，選用連續(xù)切片4張，行免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.3 圖像分析：采用Axioplan 2多功能全自動(dòng)顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察，Nikon Eclipse E600數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集，Motic Images Advanced(Ver.3.2)圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。取免疫組化切片，每張切片在第一磨牙近中頰根近中面壓力側(cè)牙根中1/3處任意選擇三個(gè)區(qū)域，以交互方式進(jìn)行測(cè)量分析，選用參數(shù)為面積百分比（百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/一個(gè)高倍視野鏡下細(xì)胞總數(shù)）。以三次測(cè)量值的均值作為該動(dòng)物在此時(shí)間點(diǎn)的實(shí)測(cè)值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析比較不同實(shí)驗(yàn)組、不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。以 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 不給藥組壓力側(cè)牙周組織內(nèi)MMP-13的表達(dá)與分布：在空白對(duì)照組：生理狀態(tài)下，MMP-13 呈弱陽性表達(dá)，在臨近骨吸收處的骨細(xì)胞呈現(xiàn)MMP-13免疫反應(yīng)陽性。如圖1.1。

在受力不給藥組：實(shí)驗(yàn)組大量細(xì)胞呈現(xiàn)MMP-13免疫反應(yīng)陽性，主要集中在根吸收和骨吸收處。在骨吸收區(qū)，MMP-13免疫反應(yīng)陽性主要出現(xiàn)在破骨細(xì)胞下的骨表面，在一些骨細(xì)胞及其陷窩處也呈陽性，而且陽性的骨細(xì)胞趨向于靠近破骨細(xì)胞，但破骨細(xì)胞本身不呈陽性。在骨吸收區(qū)的骨表面的成骨細(xì)胞和靠近破骨細(xì)胞的成纖維細(xì)胞也顯示陽性。而在根吸收區(qū)，臨近破牙細(xì)胞的成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)陽性，但破牙細(xì)胞不顯示陽性。如圖1.2、1.3、1.4

2.2 不給藥組壓力側(cè)牙周組織內(nèi)MMP-13表達(dá)的時(shí)相性變化：正常條件下，大鼠磨牙存在生理性的遠(yuǎn)中漂移，因而其牙根的遠(yuǎn)中側(cè)可見MMP-13的弱陽性表達(dá)，見圖2.1。加力后，磨牙向近中移動(dòng)，因而其牙根的近中側(cè)可見MMP-13的陽性表達(dá)，見圖2.2。大鼠在加力10天后，牙周組織內(nèi)的MMP-13表達(dá)出現(xiàn)峰值，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖2.3。第14天則表達(dá)趨于平穩(wěn)，見圖2.4。方差分析顯示，大鼠加力后第7天MMP-13的陽性率顯著高于未加力時(shí)，加力后10天的陽性率顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)（P<0.01）。見表1，圖3.1。

2.3 各受力組壓力側(cè)牙周組織內(nèi)MMP-13表達(dá)的時(shí)相性變化：在各受力組，第7天和第10天給藥受力組的MMP-13 的陽性表達(dá)低于受力不給藥組。給藥受力組MMP-13 的陽性表達(dá)在第10天明顯更低（P<0.01）。兩實(shí)驗(yàn)組MMP-13 的陽性表達(dá)都在第10天到達(dá)峰值后第14天趨于平穩(wěn)（見表1，圖3.2、3.3、3.4、3.5）。

3討論

正畸牙齒移動(dòng)過程中的牙槽骨和牙周膜的改建是一個(gè)較特殊的過程。MMPs在骨改建過程中發(fā)揮了不可替代的作用，在正常骨組織中，MMPs由多種細(xì)胞以酶原的形式合成分泌。骨基質(zhì)的正常生理代謝依賴于MMPs及其抑制因子兩者之間的平衡關(guān)系[4]。當(dāng)骨組織受到外來刺激或病變時(shí)，破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成分泌MMP酶原，MMP酶原在細(xì)胞外受多種激活機(jī)制作用而被激活。這些蛋白酶根據(jù)作用底物特異性在骨改建的不同階段對(duì)降解胞外基質(zhì)起著關(guān)鍵作用。而破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞在行使破骨、成骨功能及遷移運(yùn)動(dòng)時(shí)依賴MMPs對(duì)骨基質(zhì)的主要成份膠原的裂解。膠原酶不僅直接參與破骨細(xì)胞的骨吸收過程，而且是成骨細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞骨吸收的中介因子之一。

MMP-13是膠原酶中的一種，又稱膠原酶-3或骨型膠原酶，其在各種組織的細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中都發(fā)揮了重要作用[2]。與其他MMPs相比，MMP- 13在骨基質(zhì)降解過程中起了尤為重要的作用，Pivetta E[5]的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。牙根吸收與骨吸收具有一定的可比性，破牙細(xì)胞和破骨細(xì)胞形態(tài)相似，而且成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙骨質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞在功能上幾乎是同一的[6]。筆者推斷MMP-13在牙根吸收也扮演了與骨吸收中類似的重要角色。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示：在生理狀態(tài)下，MMP-13弱陽性表達(dá)，說明MMP-13參與了牙周組織的生理性改建。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示在骨吸收區(qū)，MMP-13免疫反應(yīng)陽性主要出現(xiàn)在破骨細(xì)胞下的骨表面，在一些骨細(xì)胞及其陷窩處也呈陽性，而且陽性的骨細(xì)胞趨向于靠近破骨細(xì)胞，但破骨細(xì)胞本身不呈陽性。在骨吸收區(qū)的骨表面的成骨細(xì)胞和靠近破骨細(xì)胞的成纖維細(xì)胞也顯示陽性。而在根吸收區(qū)，臨近破牙細(xì)胞的成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)陽性，但破牙細(xì)胞不顯示陽性。這也與Morrison C[7]等人對(duì)MMP-13的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本吻合，這進(jìn)一步驗(yàn)證了MMP-13不是來自于破骨細(xì)胞而是來自于成骨細(xì)胞。

Holliday等[8]發(fā)現(xiàn)在膠原酶抑制劑存在的條件下，破骨細(xì)胞的骨吸收作用明顯被抑制。這表明鄰近破骨細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞通過釋放大量膠原酶產(chǎn)生膠原質(zhì)片段從而激活破骨細(xì)胞的骨吸收作用。Sato等[9]將純化的破骨細(xì)胞分別培養(yǎng)于涂或未涂膠原的骨片上，在未涂膠原的的骨片上MMPs抑制劑未能抑制骨陷窩的形成，而在涂有膠原的骨片上，MMPs抑制劑有效的抑制了骨陷窩的形成。使用其他類的蛋白酶抑制劑沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這說明膠原酶不僅直接參與骨基質(zhì)的降解，而且破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在行使破骨、成骨功能及遷徙運(yùn)動(dòng)時(shí)還依賴于膠原酶的介導(dǎo)。

MMP-13不但能夠降解I、II、III型膠原，而且還是其他MMPs的激活劑。MMP-1、MMP-8、MMP-13只能夠把膠原纖維降解到其原始分子大小的1/4～3/4，而只有MMP-9能夠進(jìn)一步把膠原纖維降解到更小的分子量。Knauper V等的研究就發(fā)現(xiàn)MMP-13在基質(zhì)降解過程中，不僅能夠有效地降解I型膠原，而且還能夠有效地激活MMP-9[10]，從而使細(xì)胞外基質(zhì)充分降解。

骨吸收與根吸收起始于骨/根表面未礦化的類骨質(zhì)層的降解，由成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞合成分泌的膠原酶可以降解骨表面的類骨質(zhì)，導(dǎo)致骨/根吸收的開始。因而膠原酶在根吸收的發(fā)生過程中起到了關(guān)鍵作用。膠原酶是一組鋅和鈣依賴的內(nèi)源性肽酶，它的活化需要與Ca等金屬陽離子結(jié)合。多西環(huán)素（DOXY）是由土霉素經(jīng)6-α位脫氧得到的一種半合成抗生素，是一種金屬鰲合劑，可競(jìng)爭(zhēng)性與Ca 等金屬陽離子結(jié)合，抑制膠原酶活化，從而減少活性膠原酶合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。DOXY可與牙骨質(zhì)結(jié)合，緩慢釋放，較長(zhǎng)時(shí)間地維持抗膠原酶活性[11]。

Lee HH[12]等人通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素能夠有效的抑制膠原酶活性，從而抑制骨基質(zhì)的降解。Bedi A等[13]的研究指出多西環(huán)素能通過抑制MMPs活性而抑制大鼠結(jié)締組織降解。Tüter G[14]等的研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素能抑制牙周病患者齦溝液中的膠原酶活性進(jìn)而幫助抑制牙周炎的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用SD大鼠建立動(dòng)物模型，觀察多西環(huán)素對(duì)大鼠正畸移動(dòng)牙根吸收組織內(nèi)膠原酶活性的抑制情況。在本研究中，第7天和第10天給藥受力組的MMP-13 的陽性表達(dá)低于受力不給藥組。給藥受力組MMP-13 的陽性表達(dá)在第10天明顯更低（P<0.01）。組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明多西環(huán)素對(duì)大鼠根吸收組織內(nèi)MMP-13的表達(dá)有抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示由成骨細(xì)胞分泌釋放的骨型膠原酶（MMP-13），能夠降解破壞根表面有機(jī)質(zhì)中的膠原纖維，并激活其他MMPs，協(xié)同作用使有機(jī)質(zhì)層下的礦物質(zhì)成份暴露；同時(shí)還能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和活化，從而最終導(dǎo)致了根面的破骨性吸收。而多西環(huán)素也可能主要是通過抑制破骨細(xì)胞功能和膠原酶的活性來抑制根吸收的發(fā)生。然而，這些藥物在抑制不利根吸收發(fā)生的同時(shí)，是否也會(huì)抑制正畸牙齒移動(dòng)過程中的有利破骨活動(dòng)呢？如何權(quán)衡兩者之間的利弊問題等等，這都還有待于進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Linsuwanont-Santiwong B,Takagi Y,Ohya K,et al. Expression of MT1-MMP during deciduous tooth resorption in odontoclasts[J].J Bone Miner Metab,2006,24(6):447-453.

[2]Hiroaki Nakamura,Ginga Sato,Azumi Hirata,et al.Immunolocalization of matrix metalloproteinase-13 on bone surface under osteoclasts in rat tibia[J].Bone,2004,34:48-56.

[3]Mohammadi Z.Local applications of tetracyclines in endodontics and dental trauma: a review. [J].Dent Today,2009,28(1):95-96,98,100-101.quiz 101.

[4]Johansen JS,Williamson MK,et al.Identification of proteins secreted by human osteoblastic cells in culture[J].J Bone Miner Res,1992,7(5):502-512.

[5]Pivetta E,Scapolan M,Pecolo M,et al.Spessotto P.MMP-13 stimulates osteoclast differentiation and activation in tumour breastbone metastases[J].Breast Cancer Res,2011,27,13(5):R105.

[6]Holmes SG,Still K, Buttle DJ,et al.Chemically modified tetracyclines act through multiple mechanisms directly on osteoclast precursors[J].Bone,2004,35:471-478.

[7]Morrison C,Mancini S,Cipollone J,et al.Microarray and proteomic analysis of breast cancer cell and osteoblast co-cultures:role of osteoblast matrix metalloproteinase (MMP)-13 in bonemetastasis[J].J Biol Chem, 2011, 30,286(39):34271-34285.

[8]Holliday LS,Welgus HG,et al.Initiation of osteoclast bone resorption by interstitial collagenase[J].J Biol Chem,1997,272(35):22053-22058.

[9]Sato T,Foged NT,Delaisse JM.The migration of purified osteoclasts through collagen is inhibited by matrix metalloproteinase inhibitors[J].J Bone Miner Res,1998,13(1):59-66.

[10]Knauper V,Smith B, Lopez-Otin C,et al.Activation of progelatinase B (proMMP-9) by active collagenase-3 (MMP-13)[J].Eur J Biochem,1997,248:369-373.

[11]樊明文.口腔生物學(xué)[M],2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:320-324.

[12]Lee HH,O'Malley MJ,Friel NA,et al. Effects of doxycycline on mesenchymal stem cell chondrogenesis and cartilage repair[J].Osteoarthritis Cartilage,2013,21(2):385-393.

[13]Bedi A,Fox AJ,Kovacevic D,et al.Rodeo SA.Doxycycline-mediated inhibition of matrix metalloproteinases improves healing after rotator cuff repair[J].Am J Sports Med,2010,38(2):308-317.

[14]Tüter G,Serdar M,Kurtis B,et al.Effects of scaling and root planing and subantimicrobial dose doxycycline on gingival crevicular fluid levels of matrix metalloproteinase-8,-13 and serum levels of HsCRP in patients with chronic periodontitis[J].J Periodontol,2010,81(8):1132-1139.

[收稿日期]2014-03-28[修回日期]2014-05-05

編輯/張惠娟