任亞超 蔣海月 楊 青 王進茂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000) (北京師范大學(xué)) (河北農(nóng)業(yè)大學(xué))

近年來，植物耐鹽種質(zhì)資源評價［1－2］及耐鹽育種材料的篩選［3－4］在國內(nèi)外被廣泛關(guān)注，許多學(xué)者從鹽堿脅迫下樹木生長發(fā)育［5］、生理生化反應(yīng)［6］、基因工程在樹木抗鹽堿方面的運用［7－8］等方面開展了大量研究。植物種子繁殖的實生個體、基因型不同，存在廣泛的遺傳多樣性，通過鹽脅迫篩選，能否篩選出適應(yīng)高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件的基因型，是通過鹽脅迫篩選培育耐鹽新品種的重要理論基礎(chǔ)。

三裂葉漆具有較高的耐鹽性，在0 ～0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下能夠正常生長。相關(guān)研究已經(jīng)對三裂葉漆在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下各生理特性發(fā)生的變化進行了分析［9］。但迄今有關(guān)不同鹽脅迫對實生個體基因型篩選及對篩選個體所組成的群體遺傳結(jié)構(gòu)影響的研究尚少見報道。基于此，本研究通過設(shè)置4個鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(分別為園土(CK)、0.2%、0.4%、0.6%)，對三裂葉漆實生苗群體進行鹽脅迫篩選，篩選出耐高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫的三裂葉漆實生苗群體，并通過對不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下篩選出的群體進行SSR 標(biāo)記分析，從DNA 水平分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)的變化，揭示鹽脅迫篩選對三裂葉漆群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響，證明鹽脅迫篩選耐鹽基因型的可行性。

1 材料與方法

三裂葉漆(Rhus trilobata)由格林種業(yè)從美國引進，試驗土壤為天津市大港區(qū)鹽堿土與河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園土壤混合配制，經(jīng)鹽分測定，天津市大港區(qū)鹽堿土壤含鹽率為1.4%，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園土壤含鹽率為0.06%，按照試驗設(shè)定的鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)本園土(CK)、0.2%、0.4%、0.6%進行配比，將標(biāo)本園土壤作為對照(CK)。做(長11 m×寬1.4 m×深0.3 m)畦，畦內(nèi)整體覆以整塊厚塑料布，防止鹽分滲漏，將配比好的土壤置于畦內(nèi)，做成不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的4 個畦。種子在播種前用1% Na2CO3浸泡半天后搓洗，再沙藏處理90 ～120 d，2008年春天，進行播種。同時將種子平均分成4 份(每個處理播種一份，每份為600 粒種子)，以條播方式播種于試驗土壤中，并覆薄膜以保溫、保濕。播種后60 d，從不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下形成的4 個群體中，每個群體30 個個體上采集新鮮葉片，取樣30 株，帶回實驗室低溫保存?zhèn)溆茫糜贒NA 提取，并觀測各群體的出苗情況。

DNA 的提取及檢測:由于三裂葉漆葉片中含有大量酚類等不利于DNA 提取的物質(zhì)，在常規(guī)的CTAB 法基礎(chǔ)上進行了技術(shù)改進，即采用先充分碎破組織和細胞，離心去除存在于細胞質(zhì)中的大量影響DNA 提取質(zhì)量的多酚類等次生代謝物質(zhì)，收集細胞核，再行裂解、分離提純的方法［10－12］。其中經(jīng)過去除蛋白和色素物質(zhì)后，在DNA 溶液中加入核糖核酸酶，去除其中存在的RNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA 進行檢測，觀察其完整性。

SSR 引物篩選:9 對SSR 引物引自文獻［13］，采用Ahmad［14］SSR 原始擴增條件進行引物篩選，試驗重復(fù)2 次。選取條帶清晰、帶型簡單且具穩(wěn)定多態(tài)性的7 對作為本試驗的引物。凡是個體中出現(xiàn)無效等位基因擴增或SSR 位點無擴增產(chǎn)物處，PCR 和電泳產(chǎn)物分析再重復(fù)1 次。本研究所用的7 對SSR 引物的退火溫度均為48 ℃，詳細信息見表1。

PCR 及電泳:本試驗所采用的PCR 反應(yīng)體系參照文獻［15］、［16］，并在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化改動。反應(yīng)體系為10 ×PCR buffer 1.0 μL，2.5 mM dNTP 0.25 μL，F(xiàn)orward primer (10 mM)0.4 μL，Reverse primer (10 mM)0. 4 μL，Template DNA (5 ng·μL－1)5.0 μL，rTaq DNA 聚合酶(5 U·μL－1)0.2 μL，補充ddH2O 至總體系為10 μL。

PCR 反應(yīng)程序參照文獻［15］、［16］，在此基礎(chǔ)上有改動，具體程序如下:95 ℃10 min(95 ℃1 min，48℃50 s，72 ℃50 s)，35 個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束后，配制10%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取擴增產(chǎn)物1 μL 進行上樣電泳，恒壓200 V，當(dāng)指示劑距膠底部1 cm 處停止電泳，剝膠染色。試驗中所用標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量為SSR(pUC18/MspI)DNA Marker。銀染程序參照文獻［17］。

對試驗結(jié)果分別用“1”和“0”記錄帶的有或無。用POPGENE 1.32 軟件計算等位基因頻率、等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測等位基因數(shù)(Na)、香農(nóng)指數(shù)(Ⅰ)和Nei’s 指數(shù)(H)。根據(jù)遺傳距離用UPGMA(Unweight Pair－group Method using Arithemetic Averages)方法進行聚類分析，并繪制樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對種子發(fā)芽的影響

以CK 出苗率為100%，計算每個鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下的相對出苗率。在0.2%和0.4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下，相對出苗率分別為115%和110%，鹽脅迫對種子發(fā)芽影響很小;在0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下，相對出苗率為90%，種子萌發(fā)受到一定的抑制。

2.2 SSR 擴增結(jié)果

首先用CK 群體的1 ～30 號進行引物篩選，除ptms－7 和ptms －45 不能擴增出條帶外，其余7 對引物均能穩(wěn)定重復(fù)地擴增出相應(yīng)產(chǎn)物。用篩選出的7 對SSR 引物對4 個三裂葉漆群體(CK、0.2%、0.4%、0.6%)進一步擴增，7 對SSR 特異引物共擴增出32 條帶，多態(tài)性條帶為32，多態(tài)位點百分率為100%。平均每個引物可擴增出4.6 條帶。等位位點的范圍在3 ～8 個，引物ptms －10 的等位位點數(shù)最多，其中以引物ptms－10 對樣品的擴增產(chǎn)物為例，其擴增條帶的大小為175 ～450 bp，共有8 個等位位點。圖1為SSR 引物ptms－10 對21 個三裂葉漆個體的多態(tài)性檢測結(jié)果。

在所有引物中擴增出3 個等位位點的有2 對引物，片段大小為100 ～350 bp。擴增出4 個位點的有2對引物，片段大小為125 ～200 bp;擴增出5 個等位位點的有2 對引物，片段大小為100 ～400 bp(表2、圖1)。

2.3 三裂葉漆群體遺傳多樣性及遺傳分化

根據(jù)7 對引物對4 個三裂葉漆群體擴增條帶的統(tǒng)計結(jié)果，計算了各基因座的多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等。從表2可見，7 對引物的有效等位基因數(shù)為1.408 0 ～1.566 1，平均有效等位基因數(shù)為1.528 6，其中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%群體的有效等位基因數(shù)最大，對照的最小。多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)的大小順序具有一致性;H 值變化范圍為0.252 7 ～0.330 5，變幅為0.077 8，其中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%群體的最高，為0.330 5，CK 群體最低，為0.252 7，物種水平H 值為0.319 2;而Ⅰ值變化范圍為0.392 0 ～0.494 9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的群體最高，為0.494 9，CK 群體最低，為0.392 0，物種水平Ⅰ值為0.487 3。種群內(nèi)基因多樣性為0.301 5，Nei’s 總基因多樣性為0.319 8，表明群體的差異主要來自群體內(nèi)部，群間遺傳差異不大。同時4 個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)三裂葉漆群體間的遺傳分化系數(shù)(Gs，t)為0.057 2，群體間基因多樣性(Ds，t)為0.096 5，表明4 個群體具有高度的遺傳相似性。

表2 4 個三裂葉漆群體內(nèi)的遺傳多樣性

2.4 遺傳距離和聚類分析

根據(jù)Nei(1978)的方法計算居群的無偏差遺傳距離及無偏差遺傳一致度。結(jié)果表明，4 個群體的遺傳一致度為0.027 1 ～0.053 3，其平均值為0.034 9，說明居群間遺傳分化程度較小。其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的群體遺傳一致度最小，CK 群體的遺傳距離最大;為直觀地顯示4 個三裂葉漆群體之間的相互關(guān)系，依據(jù)各居群間Nei’s 遺傳距離，采用非加權(quán)算術(shù)平均聚類方法(UPGMA)對4 個三裂葉漆群體進行聚類分析，并繪制樹狀圖(圖2)。

圖2 三裂葉漆居群基于遺傳距離的聚類圖

從樹狀圖可以看出，在遺傳相似系數(shù)為0. 03處，可以分為三類:CK 群體獨自聚為一類;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%和0.4%的兩群體聚為一類;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的群體獨自聚為一類。

3 結(jié)論與討論

張華新等［18］在鹽脅迫下11 個樹種生理特性及其耐鹽性研究中闡述三裂葉漆屬耐鹽能力較強樹種，但有關(guān)三裂葉漆SSR 標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用的報道甚少，且在國內(nèi)至今尚未見SSR 分子標(biāo)記應(yīng)用于鹽脅迫篩選出的實生群體遺傳多樣性分析、分類鑒定等方面的報道。本研究采用7 對SSR 引物對4 個鹽脅迫篩選出的三裂葉漆群體進行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析表明，7 對SSR 引物在4 個三裂葉漆群體120個個體的基因組中共得到32 條清晰穩(wěn)定的電泳條帶，每對引物的條帶數(shù)為3 ～8，平均每對引物包括4.6 個條帶，種內(nèi)多態(tài)位點百分率達100%。

三裂葉漆群體的遺傳分化系數(shù)Gs，t為0.057 2，表明4 個三裂葉漆群體具有高度的遺傳相似性。Shannon’s 信息指數(shù)和Nei’s 基因多樣度分析結(jié)果分別表明，4 個群體中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%群體的遺傳多樣性和基因多樣性最高，分別為0.330 5、0.494 9，CK群體最低，分別為0.252 7、0.392 0。Shannon’s 信息指數(shù)和Nei’s 基因多樣度揭示的結(jié)果是一致的。

依據(jù)各居群間Nei’s 遺傳距離，采用非加權(quán)算術(shù)平均聚類方法(UPGMA)對4 個三裂葉漆群體進行聚類分析，從樹狀圖可以看出，在遺傳距離0.03處，可以分為三類:CK 群體獨自聚為一類;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%和0.4%的群體聚為一類;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的群體獨自聚為一類。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%的兩個群體首先聚為一類，然后與CK 群體聚為一類，說明低度鹽脅迫篩選的三裂葉漆群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生較小變化，與CK 無鹽脅迫篩選的群體遺傳關(guān)系較近。最后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%群體聚合，說明中度鹽脅迫篩選的三裂葉漆群體的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了定向的改變，淘汰了不適應(yīng)的基因型，保留了適應(yīng)性強的基因型。鹽脅迫對三裂葉漆實生苗群體進行篩選后，通過聚類分析可以看出群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性發(fā)生了定向變化，篩選出了耐鹽基因型，從而為通過鹽脅迫篩選培育耐鹽品種奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

［1］ 宋丹，張華新，白淑蘭，等.植物耐鹽種質(zhì)資源評價及濱海鹽堿地引種研究與展望［J］.內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2006(1):37－38，44.

［2］ 宋丹，張華新，耿來林，等.植物耐鹽種質(zhì)資源評價及耐鹽生理研究進展［J］.世界林業(yè)研究，2006，19(3):27 －32.

［3］ 劉寅，賈黎明，張博，等.濱海鹽堿地綠化植物篩選及耐鹽性評價研究進展［J］.西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，31(3):80 －85.

［4］ 楊升，張華新，張麗.植物耐鹽生理生化指標(biāo)及耐鹽植物篩選綜述［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2010，25(3):59 －65.

［5］ 楊升，張華新，劉濤.16 個樹種鹽脅迫下的生長表現(xiàn)和生理特性［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2012，29(5):744 －754.

［6］ 喬慧萍，李建設(shè)，雍立華，等.植物鹽脅迫生理及其適應(yīng)性調(diào)控機制的研究進展［J］.寧夏農(nóng)林科技，2007(3):34 －36.

［7］ 尹建道，孫仲序，王玉祥，等.轉(zhuǎn)抗鹽堿基因八里莊楊大田釋放試驗［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，32(3):23 －25.

［8］ 楊春霞，李火根，程強，等.南林895 楊抗旱耐鹽基因DREB1C的轉(zhuǎn)化［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45(2):17 －21.

［9］ 宋丹.幾個引進樹種幼苗耐鹽特性及耐鹽性評價研究［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［10］ Doyle J J，Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bull，1987，19:11－15.

［11］ 潘曉華，黃儒珠，朱錦懋. 樟樹總DNA 提取技術(shù)的研究［J］.福建林業(yè)科技，2004，31(1):33 －35，43.

［12］ 王經(jīng)源，郭明亮，林文雄，等. 高多糖含量植物:蓮DNA 的提取方法［J］.福建稻麥科技，2004，22(1):8 －9.

［13］ 吳志莊.木本能源植物黃連木單株選擇、類型劃分與群落調(diào)查研究［D］.北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院，2008:41 －45.

［14］ Ahmad R. Molecular marker analyses of pistachio rootstocks by simple sequence repeatsand sequence-Related amplified polymorphisms［J］. The journal of horticultural science＆biotechnology，2005，80(3):382 －386.

［15］ Silfverberg-Dilworth E，Matasci C L，Van de Weg W E，et al.Microsatellite markers spanning the apple (Malus × domestica Borkh.)genome［J］. Tree Genetics ＆ Genomes，2006，2:202 －224.

［16］ Gianfranceschi L，Seglias N，Tarchini R，et al. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple［J］. Theor Appl Genet，1998，96:1069 －1076.

［17］ Rajora O P，Rahman M H，Buchert G P，et al. Microsatellite DNA analysis of genetic effects of harvesting in old-growth eastern white pine (Pinus strobus)in Ontario［J］. Mol Ecol，2000，9(3):339 －348.

［18］ 張華新，宋丹，劉正祥. 鹽脅迫下11 個樹種生理特性及其耐鹽性研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2008，21(2):168 －175.