夏 婷 耿興敏 羅鳳霞

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037) (金陵科技學(xué)院)

在百合育種中，花色是衡量百合觀(guān)賞價(jià)值的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)外有關(guān)百合花色的研究已有大量報(bào)道。Banba 等在有關(guān)日本百合色素資源的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)亞洲百合中的黃色和橙色百合中主要含有類(lèi)胡蘿卜素，粉色百合主要含有花青素，而百合花瓣中的花斑也主要是由花青素引起的［1－2］。根據(jù)亞洲百合和東方百合的10 個(gè)雜交品種的花色素苷成分分析結(jié)果，可以看出，百合紅色花瓣中主要含有原花青素、矢車(chē)菊色素3－O－β 蕓香糖苷7 －O－β －葡糖苷和矢車(chē)菊色素3－O－β 蕓香糖苷，而非白色花瓣中總含有原花青素［3］。近年來(lái)，國(guó)外在百合花色成分分析研究的基礎(chǔ)上，對(duì)百合花色的分子遺傳機(jī)理和基因調(diào)控等已有大量報(bào)道。研究表明，花青素苷的合成是由一對(duì)顯性基因控制的，并且花瓣與花斑中花色素苷的合成是獨(dú)立遺傳的，而類(lèi)胡蘿卜素的合成受多個(gè)基因的影響［4－6］。查爾酮合酶(CHS)和黃烷酮醇4 －還原酶(DFR)是控制亞洲雜交系百合的花瓣及花斑花色素苷累積形成的關(guān)鍵酶［4］，R2R3 －MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子LhSorMYB12 控制了東方系百合索邦的花色素合成，且與東方系百合花瓣顏色不同相關(guān)［7］。

我國(guó)有約47 個(gè)種18 個(gè)變種，其中36 個(gè)種15個(gè)變種為我國(guó)特有種［8］，占世界野生百合資源的半數(shù)以上，種類(lèi)及花色資源非常豐富。但對(duì)中國(guó)野生百合的色素資源調(diào)查、色素成分的鑒定、分離、結(jié)構(gòu)分析等還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以中國(guó)野生百合4 個(gè)組13 個(gè)種為主要試驗(yàn)材料，對(duì)其花色、基本色素成分進(jìn)行了初步分析，為其色素成分的進(jìn)一步定性、定量分析提供理論依據(jù)，為我國(guó)花色育種提供理論基礎(chǔ)及參考依據(jù)，從而促進(jìn)我國(guó)百合的花色育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2009年和2010年秋季陸續(xù)收集到分屬百合屬4 個(gè)組的13 個(gè)種的種球，然后栽植于南京林業(yè)大學(xué)溫室。具體種類(lèi)、分類(lèi)及來(lái)源見(jiàn)表1和圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同花色百合的花色測(cè)定

在百合盛開(kāi)狀態(tài)下，每個(gè)種隨機(jī)選取5 個(gè)不同單株，取新鮮花瓣，在室內(nèi)自然光條件下，將花瓣最寬部分與英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(RHSCC)進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)，用色差儀(NF333 spectrophotometer，Nippon denshoku，光源C/2°)測(cè)量花瓣最寬部分的亮度L*和兩個(gè)色度成分a*值(從綠色到紅色)及b*值(從藍(lán)色到黃色)，取平均值。使用國(guó)際照明委員會(huì)(International Commission on Illumination，CIE)系統(tǒng)進(jìn)行分析。色度C*=(a*2+b*2)1/2和色度角h=arctan(b*/a*)。

表1 試驗(yàn)材料

圖1 百合種類(lèi)

1.2.2 不同花色百合的顯色反應(yīng)

每個(gè)種隨機(jī)選擇5 個(gè)單株，取下花瓣，去除花斑部分，剪碎后混勻，分別取0.1 g 新鮮花瓣，用10%鹽酸和石油醚研磨過(guò)濾，觀(guān)察研磨液的顏色變化。百合的花斑部分單獨(dú)測(cè)試。同時(shí)用25%氨水進(jìn)行氣熏，觀(guān)察百合花瓣顏色變化［9－10］。

1.2.3 不同花色百合的紫外光譜分析

收集盛花期花瓣，去掉中梗，剪碎，分裝成3.5 g左右的小袋，用液氮速凍后放入－85 ℃貯藏。注意將帶花斑的百合，花斑部分和不帶花斑部分分開(kāi)剪裝。所有樣品收集完后，統(tǒng)一用冷凍干燥機(jī)干燥。干燥后的花瓣樣品，放入冰箱－25 ℃干燥保存待用。各色素成分樣品分析均使用0.02 g 干燥花瓣。

花瓣中葉綠素的檢測(cè):用V(丙酮)∶ V(乙醇)=9∶ 1 溶液提取，過(guò)濾并定容至5 mL。用島津公司生產(chǎn)的UV—1700 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400 ～700 nm 掃描，比色皿光徑為1 cm。葉綠素的特征吸收峰出現(xiàn)在662、644 nm 附近［11］。

花瓣中類(lèi)胡蘿卜素的檢測(cè):用V(石油醚)∶ V(丙酮)=1 ∶ 1 溶液提取，過(guò)濾定容至6 mL。在200 ～700 nm 掃描。類(lèi)胡蘿卜素的特征吸收峰出現(xiàn)在440、470 nm 附近［11］。

花瓣中類(lèi)黃酮的檢測(cè):黃色系和白色系的樣品加鹽酸化甲醇(pH =3)2 mL 置于冰箱中4 ℃提取24 h;紅色系、紫色系、粉色系和橙色系加V(HCl)∶V(MeOH)=1∶ 99 混合液2 mL 放在常溫下(大約25 ℃)避光提取24 h。過(guò)濾定容至10 mL，在220 ～600 nm 掃描。黃酮類(lèi)化合物一般有2 個(gè)吸收帶，分別是240 ～285 nm 和300 ～550 nm。甲醇溶劑提取的花色素苷最大吸收波長(zhǎng)在520 ～560 nm［11－12］。

1.2.4 不同花色百合類(lèi)黃酮的特征顯色反應(yīng)

稱(chēng)取干燥的花瓣粉末0. 1 g，用V(HCl)∶ V(MeOH)=1∶ 99 的鹽酸化甲醇溶液提取15 h，過(guò)濾并定容至25 mL，備用［13－15］。

濃鹽酸—鎂粉反應(yīng):取2 mL 提取液，加入少量鎂粉并加5 滴濃鹽酸，搖勻，靜置1 h。

濃鹽酸—鋅粉反應(yīng):取2 mL 提取液，加入少量鋅粉并加10 滴濃鹽酸，搖勻，靜置1 h。

金屬鹽類(lèi)試劑的絡(luò)合反應(yīng):三氯化鋁反應(yīng)，取2 mL 提取液，加1.0%的AlCl3·6H2O 甲醇溶液1 mL。

醋酸鉛反應(yīng):取2 mL 提取液，加1. 0% 的Pb(CH3COO)·3H2O 溶液2 mL，搖勻，靜置2 h。

氨性氯化鍶反應(yīng):取2 mL 提取液，加10 滴0.01 mol·L－1的SrCl2·6H2O 甲醇液，再加10 滴被氨水飽和的甲醇液(取甲醇10 mL，加氨水定容至25 mL)，搖勻，靜置1 h。

三氯化鐵反應(yīng):取2 mL 提取液，加5. 0% 的FeCl3·6H2O 溶液2 mL。

硼酸反應(yīng):取2 mL 提取液，加10 滴1.0%的H2O2C4·2H2O 溶液，再加3 mL 2. 0%的H3BO3溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花色百合的花色測(cè)定結(jié)果

根據(jù)比色卡比較結(jié)果以及色差“CIELAB”分布(表2、圖2)，將試驗(yàn)中所用百合初步分為四大色系:橙色系(O)包括毛百合、有斑百合、細(xì)葉百合、蘭州百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合;紫色系(P)包括鹿子百合、垂花百合;黃色系(Y)包括通江百合(2009)、岷江百合(下部);白色系(W)包括岷江百合(上部)、寶興百合、通江百合(2010)、鐵炮百合。雖然，岷江百合花瓣基部呈現(xiàn)黃色，但仍將其歸于白色系(W)。2009年收集的通江百合，收獲子球，在第二年栽植后，或許因種球的退化及環(huán)境的不適應(yīng)性，花色變淺，基本呈白色。

表2 百合花色測(cè)定結(jié)果

圖2 不同花色百合的“CIELAB”分布

2.2 不同花色百合的顯色分析結(jié)果

氨水、10% HCl 及石油醚顯色反應(yīng)結(jié)果如表3所示。觀(guān)察石油醚研磨過(guò)濾液顏色，橙色系的所有百合、白色系的岷江百合下部的過(guò)濾液呈現(xiàn)不同程度黃色，說(shuō)明其含有類(lèi)胡蘿卜素，其中有斑百合類(lèi)胡蘿卜素含量較高，其次是毛百大花卷丹和輪葉百合等，而蘭州百合、卷丹的類(lèi)胡蘿卜素含量較低。觀(guān)察10% HCl 研磨過(guò)濾液顏色，紫色系的百合顯色結(jié)果表明其含有花青素，紫色系的鹿子百合和垂花百合氨水氣熏后花瓣顏色變綠，是由花色苷呈現(xiàn)的藍(lán)色和類(lèi)黃酮呈現(xiàn)的黃色混合而成，說(shuō)明其同時(shí)含有類(lèi)黃酮和花青素苷，而鹿子百合的花瓣白色邊緣變黃，說(shuō)明其含有黃酮色素;白色系百合及黃色系百合的百合花瓣氨水測(cè)試中也顯色不同程度的黃色，說(shuō)明其可能含有黃酮或黃酮醇色素?；ò卟糠?0%HCl 研磨過(guò)濾液顏色顯紅色，說(shuō)明其含有花青素，氨水測(cè)試后顏色發(fā)藍(lán)黑色，進(jìn)一步說(shuō)明其含有花色素苷(數(shù)據(jù)未顯示)。

表3 不同百合的顯色反應(yīng)結(jié)果

2.3 不同花色百合的紫外掃描分析

不同花色百合的紫外掃描結(jié)果如表4所示。橙色系的輪葉百合、白色系的岷江百合(下部)、鐵炮百合、通江百合(2010)以及黃色系(2009)的紫外掃描時(shí)，均在662 nm 附近出現(xiàn)了吸收峰，雖然吸收值很微小，但還是說(shuō)明這些百合花瓣中含有微量的葉綠素，這也或許因?yàn)槿訒r(shí)靠近花瓣中脈部分所致。

橙色系所有百合，白色系的岷江百合(下部)，黃色系的通江百合(2009)、黃百合在440、470 nm 附近都有吸收峰，說(shuō)明這些百合的花瓣中含有類(lèi)胡蘿卜素。白色系的鐵炮和通江百合(2010)在440 nm附近有吸收峰，但吸收值很小，說(shuō)明可能含有微量類(lèi)胡蘿卜素。這在石油醚顯色反應(yīng)中沒(méi)被觀(guān)測(cè)到，或許與類(lèi)胡蘿卜素的含量較低有關(guān)，也說(shuō)明通江百合在第2年栽植時(shí)花色變淺可能與花瓣中類(lèi)胡蘿卜素含量減少有關(guān)。

紫色系的所有百合在530 nm 附近均出現(xiàn)了吸收峰，說(shuō)明這些百合花瓣中均含有花色素苷。所有百合均在240 ～285 nm 和300 ～550 nm 出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明上述百合花瓣中含有其他類(lèi)黃酮化合物。

2.4 不同花色百合的類(lèi)黃酮特征顯色分析結(jié)果

不同花色百合的類(lèi)黃酮特征顯色反應(yīng)結(jié)果如表5所示。

2.4.1 還原反應(yīng)

橙色系的毛百合、有斑百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上部)、寶興百合、通江百合(2010)以及黃色系的通江百合(2009)與濃鹽酸加鎂粉或鋅粉反應(yīng)呈現(xiàn)橙紅～紫紅色，說(shuō)明可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)化合物。結(jié)合單獨(dú)濃鹽酸反應(yīng)做對(duì)照，紫色系的鹿子百合、垂花百合及其他色系帶花斑的百合花斑部分均出現(xiàn)不同程度的紅色，說(shuō)明其含有花色素。

2.4.2 金屬鹽類(lèi)試劑的絡(luò)合反應(yīng)

三氯化鋁反應(yīng):白色系的寶興百合、岷江百合(上、下部分)、鐵炮百合、通江百合(2010)及黃色系的通江百合(2009)表現(xiàn)為極淡黃色，意味著黃酮的存在。

醋酸鉛反應(yīng):橙色系的毛百合、有斑百合、細(xì)葉百合、蘭州百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合均出現(xiàn)黃至紅色沉淀，說(shuō)明其具有鄰二酚羥基或兼有3—OH，4 ＝O 或5—OH，4 ＝O 的化合物，并表明了其不含查耳酮和橙酮。

氨性氯化鍶反應(yīng):橙色系的卷丹、大花卷丹，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的鐵炮百合，產(chǎn)生了黃色、綠色～棕色沉淀，意味著色素分子中有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類(lèi)化合物。

三氯化鐵反應(yīng):多數(shù)黃酮類(lèi)化合物因分子中含有游離酚羥基，與三氯化鐵水溶液或醇溶液可產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，呈現(xiàn)顏色;當(dāng)含有氫鍵締合的酚羥基時(shí)，顏色更明顯。紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上、下部分)、通江百合(2009，2010)、寶興百合、鐵炮百合反應(yīng)溶液均出現(xiàn)了不同程度的綠色，說(shuō)明其黃酮類(lèi)化合物含有酚羥基。

表4 不同百合花瓣中葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素及類(lèi)黃酮紫外掃描特征吸收峰

表5 不同顏色百合的類(lèi)黃酮特征顯色反應(yīng)

2.4.3 硼酸反應(yīng)

所有色系的百合與硼酸反應(yīng)均未出現(xiàn)亮黃色，說(shuō)明所有百合均不含有5 －羥基黃酮及2’－羥基查爾酮。

3 結(jié)論與討論

本研究所用的13 種不同花色百合主要被劃分為4 個(gè)色系:橙色系、紫色系、白色系和黃色系。同一色系的品種其花瓣顏色深淺、亮度(測(cè)定值未顯示)等也存在很大差異。

不同花色的色素成分存在差異，但光譜掃描結(jié)果顯示，所有百合花瓣都含有類(lèi)黃酮化合物(不包括花色素苷)。石油醚顯色反應(yīng)和光譜掃描結(jié)果均說(shuō)明橙色系百合色素主要由類(lèi)胡蘿卜素構(gòu)成，這與Nakano et al.［6］研究發(fā)現(xiàn)亞洲雜交百合中橙色與黃色百合中主要含有類(lèi)胡蘿卜素一致。而還原反應(yīng)則顯示有斑百合、卷丹、大花卷丹和輪葉百合可能還含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)化合物。10%鹽酸顯色反應(yīng)和光譜掃描結(jié)果表明紫色系百合花瓣主要含有花色素苷，這與張圓圓等［16］通過(guò)對(duì)不同花色向日葵檢測(cè)以及張潔等［17］對(duì)顯現(xiàn)不同程度紅色貼梗海棠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花色素苷是紅色及紫色的主要色素成分結(jié)論一致。氨水測(cè)試則表明其還同時(shí)含有類(lèi)黃酮物質(zhì)，通過(guò)還原反應(yīng)進(jìn)一步分析表明這些類(lèi)黃酮物質(zhì)可能是黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)化合物。還原反應(yīng)結(jié)果顯示白色系和黃色系百合(除鐵炮百合外)花瓣也含有以上類(lèi)似物質(zhì)，三氯化鋁試劑的絡(luò)合反應(yīng)則進(jìn)一步表明岷江百合、通江百合及鐵炮百合花瓣含有黃酮色素，氨水測(cè)試反應(yīng)中白、黃色系的百合花瓣呈現(xiàn)不同程度的黃色，說(shuō)明其含有黃酮或黃酮醇。岷江百合下部黃色的花瓣中還檢測(cè)到類(lèi)胡蘿卜素的存在。另外，光譜掃描結(jié)果還顯示鐵炮百合和2009年栽培的通江百合中含有少量的類(lèi)胡蘿卜素，但峰值不明顯，可能是其含量較低的原因。輪葉百合、鐵炮百合、通江百合(2010 栽培)等部分百合花瓣中還檢測(cè)到了極微量的葉綠素存在，也可能取樣部位接近葉脈所致，這需要進(jìn)一步的分析。

所有帶花斑的百合花瓣均檢測(cè)到花色素苷的存在，這與之前學(xué)者的研究一致［4］。百合花色通常有多種色素共同顯色所致，特征顯色反應(yīng)和紫外分光光度計(jì)掃描只是對(duì)百合花色的初步定性分析，還需要結(jié)合高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法對(duì)色素的成分進(jìn)行進(jìn)一步分析。另外，在本研究中收集材料有限，中國(guó)野生百合中還有很多珍惜花色品種，如綠花百合(Lilium fargesii)、紫花百合(Lilium souliei)等，還有待于進(jìn)一步的分析、研究。

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