任韞卓，史永紅，韋金英，杜春陽，李宏博，段惠軍

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

纈沙坦對尾加壓素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

任韞卓，史永紅，韋金英，杜春陽，李宏博，段惠軍*

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的 觀察纈沙坦對尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法將體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）分為正常對照組、10-8mol/L UⅡ刺激組和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L纈沙坦組。采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡百分比；Western-Blot檢測Bax、Bcl-2的表達；熒光實時定量PCR（Real time-PCR）檢測Bax、Bcl-2mRNA水平變化。結(jié)果①FCM法檢測顯示，與正常對照組相比，10-8mol/L UⅡ刺激組細(xì)胞凋亡百分比顯著升高（P＜0.01）。10μmol/L纈沙坦能顯著降低10-8mol/L UⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的百分比（P＜0.01）。②Western-Blot顯示，10-8mol/L UⅡ刺激組，與正常對照組相比，Bcl-2表達顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明顯升高（P＜0.01）。與UⅡ刺激組相比，纈沙坦使Bcl-2表達顯著升高（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率明顯降低（P＜0.01）。③Real time-PCR顯示，10-8mol/L UⅡ刺激組細(xì)胞Bcl-2mRNA表達顯著減少（P＜0.01），BaxmRNA無明顯變化（P＞0.05）。與UⅡ刺激組相比，纈沙坦顯著升高Bcl-2mRNA水平（P＜0.01），BaxmRNA無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論纈沙坦的腎臟保護作用可能部分是通過抑制UⅡ誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

腎小管，近端；上皮細(xì)胞；纈沙坦

尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是近年發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強的縮血管活性肽，在腎臟有著豐富的表達，尤其是腎小管和集合管上皮細(xì)胞［1］。研究顯示，UⅡ在腎臟的高表達有可能有重要的意義［2］。UⅡ在腎臟病變中的作用正是研究的熱點。腎小管上皮細(xì)胞在各種病因作用下凋亡增加是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵和核心環(huán)節(jié)之一。纈沙坦（valsartan，Val）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（angⅡtype 1 receptor antagonism，AT1RA），從受體水平上阻斷AngⅡ的生物學(xué)作用。AT1RA在降低血壓、減少尿蛋白、改善腎小球和小管間質(zhì)損傷以及保護腎功能上具有肯定的效果。本研究著重探討纈沙坦能否改善UⅡ誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney proximal tubular cell，HK-2）的凋亡。

1 資料與方法

1.1 材料：人腎小管細(xì)胞HK-2（ATCC Manassas，VA，USA）。纈沙坦，北京諾華制藥有限公司。UⅡ，美國Sigma公司。小鼠抗Bax單克隆抗體（P-19），兔抗Bcl-2多克隆抗體。Real time PCR試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組刺激實驗：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待HK-2細(xì)胞達75%～85%匯合后，用無血清培養(yǎng)基同步24h。分成正常對照組、10-8mol/L UⅡ刺激組和10-8mol/L UⅡ+10μmol/L纈沙坦組。干預(yù)48h后收集細(xì)胞觀察。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometric，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞的凋亡百分比：①細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集；②用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集1～5×105細(xì)胞；③加入500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；④加入5μL Annexin VEGFP混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻；⑤室溫、避光、反應(yīng)5～15min；⑥1h內(nèi)進行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。激發(fā)波長Ex=488nm；發(fā)射波長Em=530nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（fluorescene 1，F(xiàn)L1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（fluorescene 3，F(xiàn)L3）檢測。應(yīng)用Muticycle AV（FACSAria，BD Biosciences，CA，USA）分析軟件計算各期細(xì)胞百分率。

1.2.3 Western-Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白水平：

加入細(xì)胞裂解液，冰浴2h，4℃、12 000r/min離心20min，Lowry法測定上清液蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜2h，分別加入Bax、Bcl-2抗體，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體（1∶4 000稀釋），37℃孵育2h；洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影（LI.COR Gene Company，USA）。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對Western條帶進行定量分析。

1.2.4 熒光實時定量PCR檢測Bax和Bcl-2表達變化：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。熒光實時定量PCR采用20μL反應(yīng)體系，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2X）10μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，上下游引物（終濃度為1μg/L）各0.8μL，ddH2O 6μL。反應(yīng)條件為，95℃30s→95℃5s→55℃30s→72℃30s共40個循環(huán)。根據(jù)比較法計算基因表達相對量，采用公式2-ΔΔCt計算基因表達的相對倍數(shù)變化。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物列表Table 1 Primer sequences used for Real-tim e PCR analysis

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FCM檢測細(xì)胞凋亡百分比：Annexin V+PI雙染流式細(xì)胞計數(shù)散點圖以Annexin V橫軸，PI為縱軸，左上象限為損傷細(xì)胞，右上為晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞，左下為陰性正常細(xì)胞，右下為早期凋亡細(xì)胞。正常對照組細(xì)胞凋亡率為（2.25±0.12）%，UⅡ刺激組細(xì)胞凋亡率為（46.92±0.36）%。與正常組相比，UⅡ刺激組細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.01）。

UⅡ+纈沙坦組細(xì)胞凋亡率為（27.21±0.04）%，較UⅡ刺激組明顯減少（P＜0.01）。

2.2 Western-Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達：與正常對照組相比，UⅡ刺激組Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率顯著增加（P＜0.01）。與UⅡ組相比，UⅡ+纈沙坦組Bcl-2蛋白水平明顯升高（P＜0.01），Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），Bax/Bcl-2比率降低（P＜0.05），見圖1，2。

圖1 3組HK-2細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達Figure 1 The expression levels of Bax and Bcl-2 in three groups

圖2 3組HK-2細(xì)胞胞Bax/Bcl-2比率Figure 2 The ratio of Bax/Bcl-2 in three groups

2.3 Real-time PCR檢測Bax和Bcl-2mRNA水平：與正常對照組相比，UⅡ刺激組Bcl-2 mRNA表達明顯減少（P＜0.01），Bax mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。與UⅡ刺激組相比，UⅡ+纈沙坦組Bcl-2mRNA顯著升高，但BaxmRNA無明顯變化。見表2。

表2 UⅡ刺激對HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表達的影響Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

表2 UⅡ刺激對HK-2 Bcl-2 and Bax mRNA表達的影響Table 2 Effect of UⅡinterference on Bcl-2 and Bax mRNA in HK-2 (±s，n=6）

*P＜0.01 vs NG #P＜0.01 vs UⅡG by q test

Groups Bcl-2 mRNA BaxmRNA NG 1.00±0.00 1.00±0.00 UⅡG 0.08±0.02*0.92±0.13 UⅡ+Val 0.56±0.11#0.89±0.19

3 討 論

UⅡ最早是從魚的脊髓尾部下垂體中分離出的生長抑素樣環(huán)肽，是目前已知最強的縮血管活性肽。研究［3-5］表明，在許多心血管和代謝性疾病中UⅡ及其受體的水平均有上調(diào)，包括Ⅱ型糖尿病、腎功能失調(diào)、動脈粥樣硬化和肥胖等，發(fā)揮著收縮血管、舒張血管及促絲裂等作用。近年來UⅡ在腎臟的病理生理作用受到關(guān)注［6］。在慢性腎臟病及腎移植患者中UⅡ水平明顯升高［7-9］。凋亡是導(dǎo)致腎小管損傷的一種普遍機制。以往認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞的增殖和肥大是腎間質(zhì)纖維化、腎衰竭的主要原因。可是近幾年的研究［10-11］表明，腎小管上皮細(xì)胞，尤其是近曲小管上皮細(xì)胞的凋亡在腎間質(zhì)纖維化及腎功能的進一步喪失中起著重要作用。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），參與了腎臟疾病的病變發(fā)展，不僅在血流動力學(xué)調(diào)節(jié)而且在腎硬化和炎癥性、纖維化中起重要作用［12］。纈沙坦是一種AngⅡ的多肽類似物，可以通過與AT1受體結(jié)合，阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合而發(fā)揮一系列作用。AT1RA除降壓外，還具有明確的非血壓依賴性腎臟保護作用。本研究重點觀察纈沙坦能否改善UⅡ誘導(dǎo)的人HK-2的凋亡。首先選取了具有較高特異度和敏感度的Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)UⅡ刺激細(xì)胞后凋亡百分率較正常對照組顯著升高，纈沙坦和UⅡ的共同孵育能夠顯著降低凋亡率。同時還檢測了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促進基因Bax的變化。它們與細(xì)胞凋亡或存活關(guān)系尤為密切，在受到刺激后由它們之間的不同比例來決定細(xì)胞的死亡或存活［13-14］。Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白家族中最具特征的成員，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡啟動因子和阻滯因子之間的平衡來抑制凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，UⅡ刺激后Bcl-2蛋白和mRNA水平顯著下降，Bax表達無明顯變化，Bax/Bcl-2比率顯著下降。應(yīng)用纈沙坦干預(yù)后，HK-2的Bcl-2蛋白和mRNA水平較UⅡ刺激組顯著上升，Bax表達無明顯變化，Bax/Bcl-2比率下降也得到改善。推斷纈沙坦的腎臟保護作用可能是部分通過抑制UⅡ誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的凋亡實現(xiàn)的。今后將對沙坦類藥物的腎臟保護機制做更深入的研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

EFFECT OF VALSARTAN ON UROTENSINⅡINDUCED-APOPTOSIS IN HUMAN KIDNEY PROXIMAL TUBULAR EPITHELIAL CELL

REN Yunzhuo，SHIYonghong，WEIJinying，DU Chunyang，LIHongbo，DUAN Huijun*
(Department of Pathology，the School of Basic Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effect of valsartan on urotensinⅡ（UⅡ）inducedapoptosis in human kidney proximal tubular cell（HK-2）.MethodsHK-2 cellswere divided into three groups：normal group，10-8mol/L UⅡgroup，10-8mol/L UⅡ+10μmol/L Val group.Cellswere stained by annexin V/propidium iodide（PI）and apoptosis of HK-2 was analyzed by flow cytometry（FCM）.The expression levels of Bax and Bcl-2 were observed by Western-Blot.Real time-PCR was performed to assess the levels of Bax，Bcl-2mRNA.ResultsCompared with normal group（NG），the percentage of cell apoptosis significantly increased in HK-2 in UⅡstimulation group（P＜0.01）.FCM showed that valsartan made the cell apoptioic ratemuch lower than that of HK-2 of UⅡ-induced.The expressions of Bcl-2 protein and mRNA were decreased in UⅡ-stimulated HK-2 cell（s P＜0.05）.Valsartan could upregulate the expression of Bcl-2 protein and mRNA but it did not have any effect on the expression of Bax.The ratio of Bax/Bcl-2 was significantly increased in UⅡ-stimulated HK-2 cells（P＜0.01）. Valsartan could also greatly ameliorate the increase of ratio of Bax/Bcl-2（P＜0.01）.ConclusionValsartan has some renal protective effects on renal interstitial fibrosis，partly through inhibiting UⅡinduced-apoptosis in human kidney proximal tubular cell.

kidney tubules，proximal；epithelial cells；valsartan

R332

A

1007-3205（2013）09-0993-04

2013-08-01；

2013-08-11

國家自然科學(xué)基金（30100244）；河北省教育廳科學(xué)研究計劃項目（2007130）；河北省自然科學(xué)基金（30100098）

任韞卓（1978-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事腎臟病理學(xué)研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.001