紀平雄，黎潔玲，曾榮光

(華南農(nóng)業(yè)大學理學院生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

響應曲面法優(yōu)化葉綠素銅的制備工藝

紀平雄，黎潔玲，曾榮光

(華南農(nóng)業(yè)大學理學院生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

以竹葉為原料提取葉綠素，葉綠素再經(jīng)過銅代、脫脂等步驟制備油溶性葉綠素銅。對影響產(chǎn)品質量指標的銅代關鍵工藝過程，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken Design試驗設計原理，選擇三因素三水平進行銅代工藝條件響應面法分析優(yōu)化。結果表明：銅代過程最佳條件為加銅量為理論值的2.2倍、反應溫度60℃、反應時間75min。在此條件下，油溶性葉綠素銅得率4.051mg/g，檢驗結果主要指標符合食品添加劑的規(guī)定。

竹葉；葉綠素；葉綠素銅；制備工藝；響應面分析

竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoidea)多年生常綠植物，對不同環(huán)境的適應性很強，生長速度很快。我國竹林資源豐富，占世界竹林面積的25%[1]。竹葉中含有許多具有人體生理生化活性的物質，竹葉提取物有效成分包括葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素、維生素、黃酮、內(nèi)酯、多糖、氨基酸、微量元素等，這些物質具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、降血脂、預防心腦血管疾病和保護肝臟[2-3]、擴張毛細血管、疏通微循環(huán)、活化大腦、促進記憶、改善睡眠、美化肌膚等功效[4-5]。所以，對竹葉的綜合利用研究具有實際意義。

隨著科學技術的發(fā)展和大眾認識水平的提高，長期用作食品添加劑的合成色素被天然色素取代已是大勢所趨，開發(fā)安全可靠的天然色素對保障人民身體健康具有重要意義。竹葉是易于收集、來源豐富、富含葉綠素的原材料。天然的葉綠素對光和熱不穩(wěn)定，但以銅離子取代其鎂離子得到的葉綠素衍生物穩(wěn)定性大大提高，是目前使用最多的綠色色素，廣泛應用于食品、日用和醫(yī)藥等行業(yè)。有關水溶性銅代葉綠素的研究報道很多，而油溶性銅代葉綠素卻鮮見報道[6]。

本研究以乙醇為溶劑從竹葉提取葉綠素，進一步制備油溶性葉綠素銅，并利用 Box-Behnken Design(BBD)試驗設計原理[7]，探討關鍵步驟的最佳工藝條件組合，旨在為今后竹葉葉綠素成分的實際開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

毛竹(Phyllostachys heterocycla cv. Pubescens)葉采集于本校校園內(nèi)，在室外風干后，剪碎，儲存于陰涼干燥處；氯化銅、濃鹽酸、石油醚、95%乙醇均為分析純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；JJ300精密電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；RE-20000旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素的提取

稱取10g毛竹葉，加體積分數(shù)85%的乙醇溶液150mL，在加熱溫度60℃、攪拌條件下提取3.5h?；厥杖軇玫接蜖钊~綠素[8-9]。葉綠素得率的測定參照文獻[10]等方法進行，以紫外-可見分光光度計分別在645nm和663nm波長處測定吸光度，按公式(1)計算葉綠素的含量：

式中：Ca、Cb、Ct分別為葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總質量濃度/(mg/L)。

式中：V為提取液體積/mL；m為竹葉質量/g。

1.2.2 葉綠素銅的制備

將油狀葉綠素以20倍體積的石油醚溶解，加入5%的CuCl2乙醇液，用體積比1:1的鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，在恒溫水浴鍋中加熱回流，反應完成后回收溶劑，得到油狀葉綠素銅。質量指標檢定按凌關庭等[11]的方法進行。葉綠素銅得率測定時則無需回收溶劑，加入質量分數(shù)5%的NaOH乙醇溶液，繼續(xù)加熱回流。之后將反應液移入分液漏斗，加等體積蒸餾水分層兩次。參照GB 26406—2011《食品添加劑葉綠素銅鈉鹽》規(guī)定方法，水相部分于容量瓶中用磷酸鹽緩沖液定容，以磷酸鹽緩沖液作參比，測定其吸光度。按公式(3)計算葉綠素銅(以測定的葉綠素銅鈉得率表示)的得率[12]：

式中：A405nm為405nm波長處測定的吸光度；568為特殊消光值；m為竹葉質量/g。

1.2.3 葉綠素銅代步驟的單因素試驗

考察加銅量(即實際加銅量對理論加銅量的倍數(shù))、反應溫度、反應時間、pH值對葉綠素銅得率的影響，因素和水平設置見表1。

表1 單因素試驗因素與水平Table1 Variables and levels used in single factor design

1.2.4 葉綠素銅代步驟的響應面試驗

通過竹葉制備葉綠素銅的銅代步驟的單因素試驗，選取加銅量(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)設計三因素三水平進行Box-Behnken響應面試驗分析優(yōu)化，以葉綠素銅得率為響應值，確定竹葉制備葉綠素銅的銅代關鍵步驟的最佳工藝條件。響應面試驗因素與水平編碼表見表2。試驗共設17個試驗組，其中12組為析因組，5組為重復的零點組，用作試驗誤差估計。利用Design Expert 8.0.5軟件中的多元線性回歸分析程序，擬合二階多項式方程，建立各試驗因素對響應值的函數(shù)模型。

表2 響應面試驗因素與水平編碼表Table2 Variables and levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 葉綠素銅代步驟的單因素試驗

由于葉綠素銅鈉含量測定的準確度和重復性較好，所以以葉綠素銅鈉作為衡量竹葉制備油溶性葉綠素銅得率的標準[13]。

2.1.1 加銅量對葉綠素銅得率的影響

在反應溫度60℃、反應時間70min、pH2.5條件下進行葉綠素的銅代反應，考察加銅量對葉綠素銅得率的影響，見圖1。加銅量為理論值的2.25倍時葉綠素銅得率最高，而1.5倍時最低。加銅量對葉綠素銅得率的影響是隨加銅量的增加明顯提高，達到最大值后出現(xiàn)下降。這是因為竹葉葉綠素提取液中還含有許多其他組分，這些組分在加銅量太高或太低時對葉綠素的溶解和銅代反應有很大干擾，因此加銅量比一般反應要求的理論值(1.1～1.3倍)高得多，但有一個合適的范圍，即2.0～2.3倍。

圖1 加銅量對葉綠素銅得率的影響Fig.1 Effect of copper dosage on the yield of copper chlorophyllin

2.1.2 反應溫度對葉綠素銅得率的影響

取加銅量為理論值的2.2倍、反應時間70min、pH2.5，在不同溫度條件下進行葉綠素的銅代反應，考察反應溫度對葉綠素銅得率的影響，見圖2。葉綠素銅得率開始隨著反應溫度的升高而提高，50～60℃溫度區(qū)間的葉綠素銅得率差別較大，說明在這個溫度區(qū)間內(nèi)葉綠素銅代反應效率增長較快。而在60～70℃的溫度區(qū)間內(nèi)，葉綠素銅得率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于過高的反應溫度導致葉綠素的氧化和分解，從而影響到銅代反應的進程。

圖2 反應溫度對葉綠素銅得率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the yield of copper chlorophyllin

2.1.3 反應時間對葉綠素銅得率的影響

取加銅量為理論值2.2倍、反應溫度60℃、pH2.5，在不同時間條件下進行葉綠素的銅代反應，觀察反應時間對葉綠素銅得率的影響，見圖3。當反應時間為75min時，葉綠素銅得率最高，曲線反映出銅代反應的效率隨著反應時間的延長而提高；但當反應時間超過75min時，銅代反應的效率開始下降，但下降的幅度較小，這是因為當銅代反應完成后，生成物繼續(xù)處于高溫環(huán)境，會引起生成的葉綠素銅由于受熱破壞導致的結構改變。

圖3 反應時間對葉綠素銅得率的影響Fig.3 Effect of reaction time on the yield of copper chlorophyllin

2.1.4 pH值對葉綠素銅得率的影響

取加銅量為理論值2.2倍、反應溫度60℃、反應時間75min，在不同pH值條件下進行葉綠素的銅代反應，觀察pH值對葉綠素銅得率的影響，見圖4。pH值的控制對銅代率的影響非常顯著，這是由于銅代反應是在酸性條件下進行，pH值偏高會使葉綠素脫酯，影響其在石油醚中的溶解從而阻礙銅代反應的進行；在pH值偏低時葉綠素也容易脫鎂而不易發(fā)生銅代反應。pH2～3是銅代反應必須嚴格控制的范圍，在此pH值范圍內(nèi)才能確保銅代完全。

圖4 pH值對葉綠素銅得率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of copper chlorophyllin

2.2 葉綠素銅代步驟的響應面試驗

2.2.1 響應曲面試驗結果和數(shù)據(jù)分析

按照響應面設計的因素和水平表，對自變量加銅量(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)與因變量即響應值葉綠素銅得率(Y)的關系進行響應面試驗，設計方案及結果見表3?？煽闯鰧崪y值和預測值數(shù)據(jù)很接近。

表3 葉綠素銅代工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

圖5是響應面模型實測值和預測值的擬合曲線，可以直觀地看出擬合曲線幾乎是一條直線，說明模型可以較好地描述各個自變量與因變量之間的相互關系。進一步由軟件Design Expert對試驗得到的響應值葉綠素銅得率進行回歸分析，初步建立起模型的二次回歸方程：

Y=－6.57150＋3.46850A＋0.19858B＋0.021800C－2.00000×10-3AB＋8.33333×10-4AC－1.58333×10-4BC－0.78400A2－1.51000B2－9.27778×10-5C2

表4是模型的方差分析及相關系數(shù)，可觀察模型各個變量之間的擬合程度。可見模型F值43.93，P＜0.0001，RSN=18.696，表明該模型出現(xiàn)噪音的機會只有0.01%。回歸模型的決定系數(shù)R2為0.9826，說明98.26%的試驗結果可以由這一模型來解釋。調(diào)整決定系數(shù)為0.9606，預測決定系數(shù)為0.8832，兩者之差在允許范圍。由失擬性該項的方差分析可知，F(xiàn)值很小，P值很大，表明該項對模型影響很小，證明模型的擬合結果很好。另外，B、BC(P＜0.05)對模型有顯著影響，C、C2(P＜0.01)有很顯著影響，A、A2、B2(P＜0.0001)有極顯著影響。盡管AB和AC對模型沒有顯著影響，但模型若沒有這兩項，會導致模型方差及相關系數(shù)的較大變化，失去原有很好的擬合結果，因而初步建立的模型也是最優(yōu)的模型[14]。

圖5 響應曲面模型實測值和預測值的擬合曲線Fig.5 Good agreement between the experimental and model predicted yield of copper chlorophyllin

表4 葉綠素銅得率與試驗因素關系的回歸模型分析Table4 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 交互影響因素顯著性分析

圖6 各兩因素交互作用對葉綠素銅得率影響的響應面圖及等高線圖Fig.6 Response surface plots showing the interaction effects of three reaction conditions on the yield of copper chlorophyllin

由圖6a可知，當反應時間為60min時，反應溫度在60～65℃之間，加銅量在2.15～2.30倍之間對增加葉綠素銅得率最有利。反映溫度影響的曲線較平滑，這說明在試驗溫度范圍，葉綠素及其他脂溶性物質溶解性都很好，只有銅離子達到一定濃度才能保證葉綠素銅代反應的完全進行。

由圖6b可知，當反應溫度為60℃時，延長反應時間，葉綠素銅得率提高，在反應時間為75～85min之間，加銅量為2.15～2.30之間的條件下，葉綠素銅得率最高。這是因為只有達到足夠長的反應時間才能克服雜質的干擾，使葉綠素中心鎂離子被銅離子取代。

由圖6c可知，當加銅量為理論值的2.0倍時，反應溫度和反應時間兩者對竹葉葉綠素銅得率的交互影響顯著，隨反應溫度的升高和反應時間的延長，葉綠素銅得率不斷提高，反應溫度60～65℃、反應時間75～85min是最優(yōu)組合。

2.2.3 驗證實驗

由回歸模型，求得最優(yōu)工藝條件是實際加銅量為理論加銅量的2.18倍、反應溫度60.34℃、反應時間75.75min，竹葉葉綠素銅得率的理論值為4.018mg/g。但這一最佳組合未包括在響應面試驗設計組中，需做進一步實驗驗證。為了方便驗證試驗條件的控制，改為加銅量2.2倍、反應溫度60℃、反應時間75min，由此得到葉綠素銅得率為4.051mg/g。表明在此反應條件下，葉綠素銅得率實測值與預測值相差不大，說明該模型方程與實際情況很好擬合，證明所建模型是正確的，可以肯定響應面法對竹葉葉綠素銅代過程工藝條件進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化的結果是可靠的。

2.3 精制油溶性葉綠素銅的質量檢測

表5 油溶性葉綠素銅的質量指標及檢測結果Table5 Quality indicators of crude and refined copper chlorophyllin

將未脫脂精制的銅代葉綠素進行質量檢測，由表5可知，與食品添加劑規(guī)定的質量指標相比，檢測值中只有消光比一項在規(guī)定的范圍內(nèi)，特殊消光值和含量這兩項均不合格且相距較大。因此，需要經(jīng)丙酮進一步脫脂精制，才可能得到合格的產(chǎn)品。進一步脫脂精制后的檢測結果表明，脫脂精制處理是關乎葉綠素銅產(chǎn)品質量的重要純化步驟。經(jīng)處理后的銅代葉綠素的特殊消光值合格，且含量提高了差不多1倍，這是由于脫脂處理去除了脂溶性雜質使產(chǎn)物純度提高。另一方面是一些氧化生成的、不能起銅代反應的葉綠素衍生物，由于極性較之葉綠素銅小，不易溶于丙酮而沉淀除去，這些雜質往往對葉綠素銅的消光值有消長作用，導致質量不合格[15-16]。

3 結 論

本實驗以竹葉為原料、乙醇為溶劑提取葉綠素，葉綠素再經(jīng)過銅代、脫脂等步驟制備油溶性葉綠素銅。對影響產(chǎn)品質量指標的銅代關鍵工藝過程，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken Design試驗設計原理，選擇三因素三水平進行銅代工藝條件響應面法分析優(yōu)化，建立了實際加銅量(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)與油溶性葉綠素銅得率之間的二次多項回歸模型：Y=-6.57150＋3.46850A＋0.19858B＋0.021800C-2.00000×10-3A B＋8.3 3 3 3 3×1 0-4A C-1.5 8 3 3 3×1 0-4BC-0.78400A2-1.51000B2-9.27778×10-5C2。從模型的方差分析及相關系數(shù)數(shù)據(jù)可證明模型對各個變量之間的擬合結果很好，各因素影響葉綠素銅得率的主次順序為實際加銅量A＞反應溫度B＞反應時間C，可應用于竹葉葉綠素銅代工藝過程條件控制。通過以模型的響應面對影響油溶性葉綠素銅得率的主要因素及其相互作用進行探討，優(yōu)化出竹葉葉綠素銅代工藝過程條件的最佳條件為實際加銅量為理論加銅量2.2倍、反應溫度60℃、反應時間75min，葉綠素銅得率為實測值4.051mg/g、預測值4.018mg/g，兩者相差不大，進一步證明所建模型是正確的，響應面法對竹葉葉綠素銅代過程工藝條件進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化的結果是可靠的[17-20]。此外，葉綠素銅代后得到的只是粗品，需要經(jīng)過丙酮進一步脫脂精制，才可能得到合格的產(chǎn)品，脫脂精制處理是關乎油溶性葉綠素銅產(chǎn)品質量的重要純化步驟。

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Optimization of the Preparation of Oil-Soluble Copper Chlorophyllin from Bamboo Leaves

JI Ping-xiong，LI Jie-ling，ZENG Rong-guang
(Institute of Biomaterial, College of Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Chlorophyllin was extracted from bamboo leaves and used to prepare oil-soluble copper chlorophyllin by copper replacement and degreasing. The procedure of copper replacement critical for the quality of copper chlorophyllin was optimized by response surface methodology based on a three-variable, three-level Box-Behnken design. The optimal conditions for copper replacement were established as follows: the amount of copper was 2.2-fold of the theoretical amount and the reaction was allowed to proceed for 75 min at 60 ℃. Under these conditions, the yield of copper chlorophyllin was 4.051 mg/g. The main quality indicators of the final product obtained met the requirements for use as a food additive.

bamboo leaves；chlorophyll；copper chlorophyllin；preparation；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2013)18-0087-05

10.7506/spkx1002-6630-201318018

2012-09-19

華南農(nóng)業(yè)大學“211工程”三期重點建設項目(2009B010100001)

紀平雄(1956—)，男，副教授，本科，研究方向為應用化學與生物資源利用。E-mail：xiongpj16591@163.com