楊志剛，張燕萍，楊海定

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500)

超聲波輔助提取常熟黑米類(lèi)黃酮及其抗氧化活性分析

楊志剛，張燕萍，楊海定

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500)

以常熟黑米類(lèi)黃酮的提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，并通過(guò)測(cè)定常熟黑米類(lèi)黃酮對(duì)DPPH自由基、羥自由基(?OH)、超氧陰離子自由基(O-2?)的清除作用，研究其抗氧化活性。結(jié)果表明：常熟黑米類(lèi)黃酮最佳提取工藝條件為料液比1:60(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率288W、浸提溫度50℃、浸提時(shí)間40min，在此條件下提取率為1.415%。常熟黑米類(lèi)黃酮表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，但抗氧化能力小于VC，是一種很好的天然抗氧化劑。

常熟黑米；類(lèi)黃酮；超聲波輔助提?。豢寡趸?/p>

常熟黑米又名“血糯83-1”，是我國(guó)稀特稻米品種鴨血糯改良種，富含蛋白質(zhì)、維生素、天然色素及人體必需的多種微量元素，同時(shí)還含有水溶性類(lèi)黃酮以及生物堿、植物甾醇等藥用成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是一種上乘的滋補(bǔ)美食佳品，亦為食品加工、釀造業(yè)及提取天然色素的珍貴稻米。類(lèi)黃酮是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，存在于水果、蔬菜、谷物、豆類(lèi)和茶葉等許多食源性植物中，具有高抗氧化和抗自由基作用，能夠維持血管的正常滲透壓，減低血管的脆性，防止血管破裂，止血消炎，抗過(guò)敏、抗病毒，同時(shí)還有抗衰老、抗突變等保健功能[1-6]。

傳統(tǒng)的類(lèi)黃酮提取方法為煎煮法、回流提取法、索氏提取法、浸漬法、滲透法、水蒸汽蒸餾法等[7-12]。超聲技術(shù)的高頻振動(dòng)及空化效應(yīng)，可以破壞細(xì)胞組織從而強(qiáng)化浸提效果，具有提取時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取[13-16]。本實(shí)驗(yàn)以常熟黑米為原料，探討超聲波輔助提取總黃酮的最佳工藝，并研究提取物在體外的抗氧化能力，希望為進(jìn)一步有效利用常熟黑米這一寶貴植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

常熟黑米，2012年11月采收于江蘇省常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所大義種植基地。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海億欣生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、VC、BHT均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BELMark分析天平 深圳市華恒儀器有限公司；六一牌WD9419型電動(dòng)粉碎機(jī) 沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司；Lambda25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；FQ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 南京先歐儀器制造有限公司；LNG-788臺(tái)式快速離心濃縮干燥器 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 常熟黑米類(lèi)黃酮的制備

常熟黑米去穎殼后50℃條件下干燥至恒質(zhì)量，粉碎，過(guò)60目篩。取10g過(guò)60目篩的常熟黑米粉，加60%乙醇溶液600mL，料液比1:60(g/mL)、超聲功率288W、浸提溫度50℃、提取時(shí)間40min，抽濾，以100mL提取溶劑洗滌濾渣，合并2次濾液，濃縮至黏稠狀，于真空干燥箱(60℃、90MPa)中干燥得粉末2.34g，類(lèi)黃酮含量為6.02%，避光保存[18]。

1.2.2 類(lèi)黃酮含量測(cè)定

精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品25.00mg，置于100mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液，稀釋至刻度，搖勻，定容。即蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度為0.25mg/mL。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6、7、8mL于25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻靜置5min；再加入10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻靜置6min，再加入4g/100mL氫氧化鈉溶液5mL，搖勻靜置5min，最后用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻靜置10min。以第一瓶為空白對(duì)照液，用Lambda25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行回歸，得回歸方程[17]。

分別加入一定量的常熟黑米類(lèi)黃酮提取液，經(jīng)離心過(guò)濾后，定容至100mL；精確吸取10mL于50mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻靜置5min，再加入10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻靜置6min，再加入4g/100mL氫氧化鈉溶液5mL，搖勻靜置5min，最后用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻靜置10min，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度[17]。

式中：ρ為稀釋后樣品檢測(cè)溶液中類(lèi)黃酮質(zhì)量濃度；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液第1次定容的體積；m為常熟黑米粉末質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、浸提溫度(30、40、50、60、70℃)、料液比(l:20、1:30、l:40、1:50、1:60、1:70)、超聲功率(192、240、288、336、384W)、超聲波浸提時(shí)間(10、20、30、40、50min)對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素水平，見(jiàn)表1，優(yōu)化超聲波輔助提取常熟黑米類(lèi)黃酮的工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.2.5 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定[19]

精確吸取2mL不同質(zhì)量濃度(2、4、6、8、10mg/L)干燥樣品于試管中，分別加入2mL 0.2mol/L DPPH乙醇溶液，搖勻后置于25℃條件下恒溫水浴鍋中加熱30min，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Aa。同時(shí)測(cè)定2mL不同質(zhì)量濃度樣品提取液與2mL無(wú)水乙醇混勻后的吸光度Ab和2mL DPPH溶液與2mL無(wú)水乙醇混勻后的吸光度A0。用等質(zhì)量濃度的VC、BHT代替樣品做對(duì)照，按式(2)計(jì)算清除率：

1.2.5.2 對(duì)?OH清除能力的測(cè)定[20]

精確吸取3mL不同質(zhì)量濃度(2、4、6、8、10mg/L)樣品醇溶物于試管中，依次向試管中加入2mL 0.1moL/L FeSO4、2mL 0.1mol/L水楊酸、2mL 0.1mol/L H2O2，用蒸餾水定容至10mL并搖勻，在37℃條件下恒溫加熱30min后在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Aa；將體系中樣品用3mL無(wú)水乙醇代替，在相同條件下測(cè)定其吸光度A0；將體系中H2O2用蒸餾水代替在相同條件下測(cè)定其吸光度Ab。用等質(zhì)量濃度的VC、BHT代替樣品做對(duì)照，按式(3)計(jì)算清除率：

向各容量瓶中加入3mmoL/L鄰苯三酚溶液0.3mL，再分別加2mL不同質(zhì)量濃度的樣品醇溶物，用pH8.3的Tris-HCl緩沖溶液定容至9mL，迅速混勻并以蒸餾水作參比，在325nm波長(zhǎng)處每隔30s測(cè)吸光度，直到反應(yīng)啟動(dòng)后的第6分鐘結(jié)束測(cè)定，把所得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸曲線，得到的直線斜率為反應(yīng)速率ΔA、ΔA0，用等質(zhì)量濃度的VC、BHT代替樣品做對(duì)照。清除率按式(4)計(jì)算：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA為加入樣液后鄰苯三酚自氧化法速率(單位均為吸光度每分鐘的增值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提溫度對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲功率240W、超聲提取時(shí)間30min、料液比1:50(g/mL)，提取溫度分別為30、40、50、60、70℃時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處的吸光度，計(jì)算類(lèi)黃酮提取率。

圖1 浸提溫度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction of flavonoids

由圖1可知，隨著浸提溫度的升高，類(lèi)黃酮提取率逐漸升高，而后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。浸提溫度為60℃時(shí)，類(lèi)黃酮溶出較多。浸提溫度在70℃的條件下類(lèi)黃酮提取率反而比在60℃低，這是由于當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，乙醇?xì)饣焕诨钚猿煞值奈龀?，而且溫度過(guò)高，雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，活性成分易分解破壞。因此，浸提溫度選擇60℃較為適宜。

2.1.2 料液比對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度60℃、超聲功率240W、超聲提取時(shí)間30min，料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70(g/mL)時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處吸光度，計(jì)算類(lèi)黃酮提取率。

圖2 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction of flavonoids

從圖2可以看出，隨著提取液用量的增加，類(lèi)黃酮提取率也隨之增大，當(dāng)提取液用量增大到一定值后，類(lèi)黃酮提取率的增加趨于平緩?？紤]到提取液用量的提高也會(huì)增加生產(chǎn)成本及后續(xù)工藝的難度，所以料液比選擇1:60(g/mL)較適宜。

2.1.3 超聲功率對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度60℃、料液比1:60(g/mL)、超聲提取時(shí)間30min、超聲功率分別為192、240、288、336、384W，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處吸光度，計(jì)算類(lèi)黃酮提取率。

圖3 超聲功率對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

由圖3可見(jiàn)，隨著超聲功率增加，類(lèi)黃酮提取率逐漸升高，而后呈現(xiàn)略有下降的趨勢(shì)。超聲功率小時(shí)，不能使物料充分受到超聲的作用，類(lèi)黃酮提取不完全，在超聲功率達(dá)到288W時(shí)提取率達(dá)到最大，之后，類(lèi)黃酮提取率有所下降，這可能是因?yàn)槌暪β侍笤斐深?lèi)黃酮降解，因此，選擇超聲功率為288W較為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度60℃、料液比1:60(g/mL)、超聲功率288W，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50min時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處吸光度，計(jì)算類(lèi)黃酮提取率。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of time on the extraction of flavonoids

從圖4可知，在浸提過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)外活性成分含量未達(dá)到平衡時(shí)，提取率隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，活性成分不再溶出，提取率趨于穩(wěn)定。浸提時(shí)間在30min后，類(lèi)黃酮得率提高不顯著，因此選擇浸提時(shí)間30min為宜。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響

在浸提溫度60℃、料液比1:60(g/mL)、超聲功率288W、超聲提取時(shí)間30min、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處吸光度，計(jì)算類(lèi)黃酮提取率。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids

由圖5可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果影響較大，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)提取效果最佳，乙醇體積分?jǐn)?shù)較高和較低提取效果均不佳。這可能是不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，導(dǎo)致對(duì)類(lèi)黃酮物質(zhì)的溶解能力不同。

2.2 正交試驗(yàn)

為了確定在多因素條件下超聲輔助提取常熟黑米類(lèi)黃酮的最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇合適的參數(shù)范圍，對(duì)浸提溫度(A)、料液比(B)、超聲功率(C)、浸提時(shí)間(D)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)，采用L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取工藝見(jiàn)表2。

表2 L 2 L1616(4(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

表3 L 3 L1616(4(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results array design

由表2、3可知，試驗(yàn)中各因素對(duì)常熟黑米類(lèi)黃酮提取率的影響程度依次為B＞E＞C＞A＞D，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。常熟黑米類(lèi)黃酮提取最佳工藝參數(shù)是A2B4C3D3E1，即料液比1:60(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率288W、浸提溫度50℃、提取時(shí)間40min。在最優(yōu)條件下，重復(fù)3次測(cè)常熟黑米類(lèi)黃酮得率平均值為1.415%，與正交試驗(yàn)基本符合。

2.3 常熟黑米類(lèi)黃酮的抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

在相同條件下，不同質(zhì)量濃度VC、常熟黑米類(lèi)黃酮、BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖6所示，VC、常熟黑米類(lèi)黃酮、BHT對(duì)DPPH自由基均有較好的清除效果，且在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)果表明，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)閂C＞BHT＞常熟黑米類(lèi)黃酮。4mg/L常熟黑米類(lèi)黃酮的清除率與BHT的清除率最接近，分別為26.7%和29.2%。

圖6 常熟黑米類(lèi)黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

2.3.2 對(duì)?OH的清除能力

圖7 常熟黑米類(lèi)黃酮對(duì)?OH的清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

由圖7可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC、常熟黑米類(lèi)黃酮、BHT清除?OH的能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在2～10mg/L質(zhì)量濃度范圍，常熟黑米類(lèi)黃酮清除能力增幅較大，在質(zhì)量濃度10mg/L時(shí)，達(dá)到53.01%。在整個(gè)測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，常熟黑米類(lèi)黃酮對(duì)?OH的清除率為27.45%～53.01%，小于VC對(duì)?OH的清除率(30.45%～56.63%)，大于BHT對(duì)?OH的清除率(24.24%～44.35%)。

2.3.3 對(duì)O-2?的清除能力

圖8 常熟黑米類(lèi)黃酮對(duì)O－2?的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

由圖8可知，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，體系中加入不同質(zhì)量濃度的VC、常熟黑米類(lèi)黃酮、BHT后，清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明VC、常熟黑米類(lèi)黃酮、BHT對(duì)均有抑制作用，抑制率與質(zhì)量濃度有關(guān)，加入樣品的質(zhì)量濃度越大，其對(duì)的抑制作用越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除能力的大小順序?yàn)閂C＞常熟黑米類(lèi)黃酮＞BHT。

3 結(jié) 論

相比于傳統(tǒng)索氏提取法提取總黃酮，超聲波輔助提取法不僅可降低成本，還大大提高了黃酮的提取效率。超聲波提取可大大節(jié)省提取時(shí)間，同時(shí)超聲波有促使植物細(xì)胞破壁能力，提高功能成分的提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以乙醇為提取溶劑，超聲輔助提取常熟黑米類(lèi)黃酮，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的因素從主到次順序是料液比影響最大，其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和浸提溫度，而超聲提取時(shí)間影響最??；優(yōu)化的最佳工藝條件為：料液比1:60(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率288W、浸提溫度50℃、提取時(shí)間40min，在此條件下常熟黑米類(lèi)黃酮提取率為1.415%。

常熟黑米提取得到的類(lèi)黃酮屬于天然植物次生代謝產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)DPPH自由基、?OH、O-2?清除能力的大小研究常熟黑米類(lèi)黃酮的抗氧化性能，并以VC、BHT作參比對(duì)照，得到如下結(jié)論，清除DPPH自由基能力的大小為VC＞BHT＞常熟黑米類(lèi)黃酮；清除?OH、O-2?能力的大小均為VC＞常熟黑米類(lèi)黃酮＞BHT。常熟黑米類(lèi)黃酮具有一定的抗氧化性能，因此在天然抗氧化劑和功能食品的開(kāi)發(fā)方面均顯示出良好的前景。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Flavonids from Changshu Grown Black Rice

YANG Zhi-gang，ZHANG Yan-ping，YANG Hai-ding
(Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Changeshu grown black (duck blood) rice was optimized by single-factor experiments and orthogonal experiment design to obtain maximum flavonoid yield. The extracted flavnoids were investigated for their antioxidant activities by DPPH radical scavenging, hydroxyl radical scavenging and superoxide anion radical scavenging assays. The results showed that the optimum extraction conditions for solid-to-solvent ratio, ethanol concentration, ultrasonic power, temperature and time were 1:60 (g/mL), 60%, 288 W, 50 ℃ and 40 min, respectively. The maximum yield of flavonoids under these conditions was 1.415%. The flavonoids obtained exhibited powerful antioxidant activity in a concentrationdependent manner, which, however, was inferior to that of VC. Therefore, this study concludes that Changshu black rice is a good source of natural antioxidants.

Changshu black rice；flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant

TS201.1；TS218

A

1002-6630(2013)18-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201318024

2013-03-25

楊志剛(1977—)，男，講師，碩士，主要從事天然活性產(chǎn)物綜合利用研究。E-mail：zgy@cslg.edu.cn