譚遠貞，邵夏炎,徐淑梅，張奇志

（1.天津醫(yī)科大學生理學教研室，天津300070；2.復旦大學藥學院藥劑學教研室，上海201203）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種以老年斑和神經元纖維纏結為特征的神經退行性疾病，臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。前期大量實驗研究表明H102肽是一個極具前景的治療AD新藥[1-2]。由于H102肽體內穩(wěn)定性差，頻繁注射給藥會給老年患者帶來很大負擔，不利于臨床的應用。目前，輸送蛋白多肽類藥物的納米釋藥系統(tǒng)得到較廣泛的研究，聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）是目前最為成功地應用于藥物載體的生物可降解聚合物，但單純PLGA納米粒容易被網狀內皮系統(tǒng)吞噬，而其表面經聚乙二醇（PEG）修飾后能顯著地避開網狀內皮系統(tǒng)吞噬從而在體內達到長循環(huán)的作用[3]。由于胞吞轉運機制能夠介導納米粒載藥系統(tǒng)轉運入腦，而單純納米粒主要是起到防止藥物迅速被體內酶降解及緩慢釋藥的作用，其誘導腦毛細管內皮細胞的胞吞作用小，限制了藥物生物利用度的進一步提高。據文獻報道，經聚山梨醇酯80修飾的納米粒能增加穿透血腦屏障入腦量[4]。王華芳等[5]對PLA納米粒示蹤標記，證實了聚山梨醇酯80修飾的PLA納米粒具有穿透血腦屏障的特性，機制可能是毛細血管內皮細胞的胞吞轉運作用。為提高H102肽納米粒腦內靶向性，本文在前期工作的基礎上，制備聚山梨醇酯80修飾H102聚乳酸-羥基乙酸納米粒，并進行體內腦靶向性研究和細胞毒性的安全性評價。

1 材料與方法

1.1 材料 乙腈（色譜純，TEDIA Company，USA）；甲酸（色譜級，TEDIA，美國）；醋酸安普利肽（純度> 98.5%，大連美侖生物技術有限公司）；H102肽納米粒（自制）；安捷倫液質聯(lián)用儀(Agilent 1100series LC/MSD，美國)；氮吹儀(MD200-2，杭州奧盛儀器有限公司)；ICR小鼠（雄性，體質量24～26g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜和質譜條件 色譜柱：Agilent XDB C18（21mm×50mm，5μm），保護柱：Phenomenex C18（4.0mm×3.0mm，5mm），流動相：乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）=14.5∶85.5，V/V，流速：0.4mL·min-1，柱溫：40℃。電噴霧離子源（ESI），正離子模式（SIM+），離子通道選擇：H102肽為[M-H]+，m/z 645.3；安普利肽為[M-H]+，m/z 843.2。毛細管電流：2000nA，離子源溫度：100℃，干燥氣流速：3.0L·min-1。

1.2.2 生物樣品處理 （1）血漿樣品：取血漿樣品100μL，加入10μL安普利肽溶液（內標，濃度2μg· mL-1）及300μL乙腈，渦漩2min，12000r·min-1、4℃離心15min，取上清液100μL氮氣吹干，用100μL流動相復溶后，離心、取上清液10μL LC-MS進樣分析。（2）腦組織樣品：按照1:2重量比加入0.1%甲酸水，進行冰水浴勻漿。將勻漿液于4000r·min-1、4℃離心3min，取上清液150mL加入10mL內標及300mL乙腈，渦旋2min，12000r·min-1、4℃離心15min，取上清液300μL氮氣吹干，用50μL流動相復溶后，離心、取上清液10μL LC-MS進樣分析。

1.2.3 標準曲線的制備 （1）血漿標準曲線：精密移取500μg·mL-1H102肽儲備液，稀釋成100、40、20、10、4、2、1和0.4μg·mL-1工作液，取以上濃度H102肽50μL，加入50μL空白血漿，使H102肽終濃度為 50、20、10、5、2、1、0.5和 0.2μg·mL-1，按“1.2.2”項下方法處理，LC/MS測定。(2)腦勻漿液標準曲線：精密移取500μg·mL-1H102肽儲備液，稀釋成300、150、75、37.5、18.75和9.375ng·mL-1工作液，取以上濃度H102肽50μL，加入100μL空白腦勻漿液，使H102肽終濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.125ng·mL-1，按“1.2.2”項下方法處理，LC/ MS測定。

1.2.4 方法回收率和精密度 分別配制含低、中、高3個濃度的血漿和腦勻漿液H102肽樣品溶液各5份，按“1.2.2”項下方法處理，在1d內測完，之后每天各濃度配制1份樣品，連續(xù)測定5d，考察精密度。分別配制含低、中、高3個濃度的對照樣品，即加入相應體積的超純水稀釋成相應的濃度，按“1.2.2”項下方法處理，LC/MS測定。記錄峰面積，以兩者的比值計算回收率。

1.2.5 動物實驗 取ICR小鼠48只，隨機分成2組，分別按照H102肽的給藥劑量為4mg·kg-1尾靜脈注射H102-NP（注射前用0.9%生理鹽水分散）和PS-H102-NP溶液（注射前用1%聚山梨醇酯80分散）。于給藥后5、15、30、45、60和120min眼眶取血并心臟灌流分離腦組織，每時間點重復做4只小鼠，樣品按“1.2.2”項下方法處理后置-20℃冷凍保存，48h內測定。

1.2.6 細胞毒性評價 取對數生長期的BCECs細胞，胰酶消化并吹打為細胞懸液。細胞計數后調整懸液細胞濃度為1×105/mL，取100μL細胞懸液接種到96孔板，置37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液。HBSS洗兩遍后分別加入以下用無血清DMEM配制的聚山梨醇酯80（polysorbate 80，PS）：16%、8%、4%、2%和1%；單純納米粒：12.5、25、50和 100mg·mL-1；含 1%聚山梨醇酯 80（polysorbate 80,PS）納米粒：12.5、25、50和100mg· mL-1。每組設定6個復孔，同時設置調零孔和陰性對照孔。分別孵育4、24h后，去掉培養(yǎng)液，加100μL MTT（1.25mg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸掉上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處測量各孔的吸光值。根據以下公式計算細胞存活率：

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗結果采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間差異采用t檢驗法。

2 結果

2.1 標準曲線 （1）血漿標準曲線：以H102肽和內標的峰面積比值R為縱坐標，H102肽濃度C為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y=15.654x-14.78，r=0.9989，表明H102肽濃度在0.2～50μg·mL-1范圍內線性關系良好。（2）腦勻漿液標準曲線：以H102肽和內標的峰面積比值R為縱坐標，H102肽濃度C為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y= 0.0233x-0.0062，r=0.9997，表明H102肽濃度在0.3125～100ng·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2 方法回收率和精密度 血漿中低、中、高3個濃度的回收率分別為89.2%、91.1%和84.2%，日內和日間的精密度均小于4.4%。腦勻漿液中低、中、高3個濃度的回收率分別為90.2%、92.5%和87.6%，日內和日間的精密度均小于5.3%。

2.3 藥時曲線 H102-NP和PS-H102-NP小鼠靜脈注射后，H102肽在血和腦組織中的藥－時曲線見 圖1。

圖1 小鼠尾靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后在血漿和腦組織中的藥－時曲線Fig 1 Concentration-time curves of H102in plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

由圖1可知，靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后，腦組織中H102肽的濃度均在30min達峰，且在45min時仍維持較高的濃度。在相同時間點里，后者腦組織中的H102肽的濃度都較前者高。采用藥動學軟件DAS2.0對藥物濃度數據進行處理，H102-NP和PS-H102-NP在血漿和腦組織中的藥動學參數見表1。可見，PS-H102-NP在腦內的半衰期和滯留時間都延長，清除率下降，AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有較佳的腦靶向性。

表1 小鼠尾靜脈注射H102-NP和PS-H102-NP后在血漿和腦內的藥動學參數Tab 1 Pharmacokinetic parameters of plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

2.4 細胞毒性評價 不同濃度的聚山梨醇酯80和納米粒分別作用于BCECs細胞4h和24h后，細胞的存活力情況見圖2、3。

圖2 不同濃度聚山梨醇酯80對細胞活力的影響Fig 2 Cell viability of various concentration of polysorbate 80on BCECs

圖3 不同濃度H102-NP和PS-H102-NP對細胞活力的影響Fig 3 Cell viability of various concentration of H102-NP and PS-H102-NP on BCECs

由圖2可知，不同濃度聚山梨醇酯80孵育2h后，8%以上時對細胞有一定的毒性，而濃度在4%以下時細胞活力仍有80%以上，而孵育24h后，4%的濃度顯示出了較大的毒性，細胞活力下降到23%，而2%濃度對細胞毒性仍很小，細胞的活力仍達90%，故濃度為2%以下的聚山梨醇酯80具有較佳的安全性。由圖3可知，H102-NP和PS-H102-NP孵育4h后，細胞活力均隨濃度的增加有所下降，但細胞活力仍在80%以上，具有較低的毒性，兩者的差異（P>0.05）不具有統(tǒng)計學意義。在孵育24h后，濃度為12.5mg·mL-1H102-NP組和PS-H102-NP組細胞活力仍有80%以上，毒性較低，兩者的差異（P>0.05）不具有統(tǒng)計學意義。而25mg·mL-1和50mg·mL-1H102-NP組的細胞活力均降到70%左右，而對應濃度的PS-H102-NP組細胞的活力仍有80%以上，兩者的差異（P<0.05）具有統(tǒng)計學意義，表明長時間孵育后，H102-NP對細胞表現出一定的毒性，而PS-H102-NP仍具有較佳的安全性。

3 討論

藥動學研究結果表明，PS-H102-NP能增加藥物的入腦量，其在腦內的半衰期和滯留時間延長，清除率下降，且其AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有良好的腦靶向性。BCECs細胞是模擬血腦屏障的腦毛細管內皮細胞模型，納米粒透血腦屏障的機制可能是通過細胞的胞吞作用。細胞毒性結果表明，聚山梨醇酯80具有較好的安全性，且經其包衣的PS-H102-NP對細胞的毒性較未包衣的H102-NP小，表明PS-H102-NP具有較佳的安全性，其入腦量的增加不是通過破壞血腦屏障的途徑而增加的。低密度脂蛋白受體是納米粒被腦毛細管內皮細胞攝取的重要因素，PS-H102-NP在體內可能會與血漿中的載脂蛋白結合，而被低密度脂蛋白受體識別攝取入腦[6]。本實驗研制的PSH102-NP具有良好的腦靶向性和低毒性，為該劑型應用于阿爾茨海默病的治療提供了實驗依據，同時對需要腦靶向治療的藥物劑型開發(fā)具有重要的指導意義。

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