韓 冰，葛長(zhǎng)青，張宏光，高 潔，李令根，周晨光，吉國(guó)輝，楊 錚，張 亮

雷紅沖劑對(duì)腔內(nèi)治療后血管再狹窄影響的實(shí)驗(yàn)與臨床研究

韓 冰1，葛長(zhǎng)青1，張宏光1，高 潔2，李令根2，周晨光1，吉國(guó)輝1，楊 錚1，張 亮1

目的：觀察雷紅沖劑對(duì)下肢動(dòng)脈內(nèi)治療后血管支架內(nèi)再狹窄的作用。方法：健康新西蘭大白兔24只，骼動(dòng)脈血管內(nèi)支架植入成功后隨機(jī)分為：裸支架組（A），環(huán)孢素A組（B），雷紅沖劑組（C）和環(huán)孢素A加雷紅沖劑組（D）。記錄支架植入前及后28 d血管直徑，對(duì)血管組織切片行免疫組化及電鏡觀察。另選下肢動(dòng)脈閉塞患者80人，隨機(jī)等分為對(duì)照組和雷紅沖劑組行試驗(yàn)治療，觀察治療后不同時(shí)間前炎因子水平的變化及下肢動(dòng)脈血管通暢性。結(jié)果：家兔骼動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄率分別為51.4±1.69%（A），10.9±0.71%（B），21.3±1.89%（C）和10.1±3.09%（D）；下肢血管通暢率雷紅沖劑組明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）,血漿IL-10和IL-18水平及IMT（下肢動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度）顯著減低（P＜0.05）。結(jié)論：環(huán)孢素A及雷紅沖劑對(duì)支架內(nèi)再狹窄有不同程度的抑制作用，免疫排斥反應(yīng)可能為重要機(jī)制之一，雷紅沖劑科有效地干預(yù)支架內(nèi)再狹窄。

免疫排斥反應(yīng)；支架內(nèi)再狹窄；雷紅沖劑

血管內(nèi)支架植入后再狹窄（ISR）已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，血管內(nèi)支架作為一種異物植入后發(fā)生再狹窄的機(jī)制及相關(guān)因素目前尚不十分明確及肯定。本文旨在探討免疫排斥反應(yīng)參與ISR的形成過程及是否為引發(fā)其發(fā)生的重要機(jī)制之一，并觀察雷紅沖劑對(duì)下肢動(dòng)脈腔內(nèi)治療后ISR的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性新西蘭白兔24只，體質(zhì)量（2.0±0.30）kg，2～3月齡，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)：SCXK(冀)2003-1-003。

1.2 試劑及藥物 選用SP-9001/9002 His-tostain TM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒；抗體選用Mouse-Anti-PCNA增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)；Rabbit-Anti-VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；Rabbit-Anti-CDK2細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)；Rabbit-Anti-P21細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(p21Cip1)。

血管內(nèi)支架：ev3冠狀動(dòng)脈植入裸金屬支架（樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司），血管內(nèi)支架直徑3.0 mm，血管內(nèi)支架長(zhǎng)度10～18 mm。

藥物Cyclosporin A（CSA），瑞士諾華制藥有限公司生產(chǎn)；雷紅沖劑，主要成分為雷公藤、紅花、川牛漆、黃芪、甘草，河北長(zhǎng)城制藥廠加工(每袋含生藥5 g)。

1.4 主要儀器設(shè)備 BX60型顯微鏡（日本OLYMPUS），DU640分光光度計(jì)（美國(guó)貝克曼公司），S-3400N掃描電鏡（日本日立公司），Duo diagnost數(shù)字X光機(jī)（荷蘭飛利浦公司），Med6.0病理數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 白兔正常飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行血管內(nèi)支架植入術(shù)。成功后隨機(jī)分成4組：裸支架組、CSA組、雷紅沖劑組和CSA加雷紅沖劑組。

藥物治療：血管內(nèi)支架植入后，第1～5 d(沖擊量)肌肉注射CSA 7.14 mg·kg-1·d-1。第6～14 d注射1.02 mg·kg-1·d-1。第15～28 d 0.678 mg·kg-1·d-1。雷紅沖劑1 g/kg用生理鹽水稀釋成10 mL/kg，以備灌胃。

兔髂動(dòng)脈造影：固定家兔，無(wú)菌條件下暴露并分離左下肢股動(dòng)脈。穿刺注射100 mL含30 g碘的碘海醇注射液(造影劑)5～10 mL造影，顯示左側(cè)髂動(dòng)脈及右側(cè)含血管支架的髂動(dòng)脈并保存圖像。

取材：實(shí)驗(yàn)?zāi)┞樽硖幩兰彝?，無(wú)菌取出含血管支架的家兔髂動(dòng)脈血管，包括上下相鄰5 mm血管，一分為二。一部分用4%的多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋HE染色，免疫組化染色供鏡檢；另一部分用前固定液3%戊二醛固定2 h，磷酸緩沖液浸洗，冰箱中后固定，梯度脫水，供掃描電鏡觀察。

組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)算機(jī)圖像分析：將獲取的家兔髂動(dòng)脈組織進(jìn)行處理后分別切片作PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)檢測(cè)，免疫組化染色及掃描電鏡觀察。

1.6 臨床研究對(duì)象 選擇下肢動(dòng)脈閉塞性疾病患者80例，病程1個(gè)月～12個(gè)月，平均4.8個(gè)月。臨床表現(xiàn)根據(jù)Fontaine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中II級(jí)，表現(xiàn)為間歇性跛行者23例，III級(jí)，表現(xiàn)為靜息疼者39例，IV級(jí)，表現(xiàn)為潰瘍或壞疽者18例。隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組40例，男28例，女12例；平均年齡（65.8±15.2）歲。雷紅沖劑組40例，男27例，女13例；平均年齡（65.3± 14.6）歲。兩組基本資料無(wú)顯著性差異，具有可比性。

1.7 治療方法 80例均行腔內(nèi)治療（球囊擴(kuò)張、支架植入），給與皮下注射低分子肝素，5000 U/8 h 1次，連用5 d?？诜蛩釟渎冗粮窭?玻立維)75 mg/d，持續(xù)6個(gè)月。終生口服阿司匹林100 mg/d。雷紅沖劑組腔內(nèi)治療后，同時(shí)3次/d口服雷紅沖劑，每次10 g，連續(xù)6個(gè)月。

1.8 觀察指標(biāo) 術(shù)前和術(shù)后4、12、24周分別于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血，測(cè)定血漿IL-10、IL-18水平，下肢動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度（IMT）和下肢動(dòng)脈血管的通暢率。

2 結(jié)果

2.1 家兔髂動(dòng)脈狹窄血管造影定量分析 各組家兔右髂動(dòng)脈血管直徑均有不同程度狹窄，以裸支架組明顯，雷紅沖劑組、CSA組和CSA加雷紅沖劑組血管腔直徑狹窄依次減輕。見表1。

表1 各組家兔髂動(dòng)脈28 d血管造影結(jié)果(,n=6)

表1 各組家兔髂動(dòng)脈28 d血管造影結(jié)果(,n=6)

注：裸支架組與CsA組比較，aP＜0.001；裸支架組與雷紅沖劑組比較，bP＜0.001；裸支架組與CsA+雷紅沖劑組比較，cP＜0.001

基礎(chǔ)血管內(nèi)徑(mm)血管內(nèi)支架植入后即刻內(nèi)徑(mm)血管內(nèi)支架植入后即刻內(nèi)徑/基礎(chǔ)內(nèi)徑28 d后血管內(nèi)徑(mm) 28 d后血管管徑丟失(mm) 28 d后血管內(nèi)徑狹窄百分比（%）裸支架組2.46±0.02 2.87±0.02 1.17±0.01 1.21±0.05 1.25±0.03 51.4±1.69 CsA組2.48±0.15 2.90±0.01 1.17±0.01 2.17±0.03a0.27±0.02a10.9±0.71a雷紅沖劑組2.47±0.03 2.88±0.02 1.16±0.02 1.96±0.04b0.51±0.04b21.3±1.89bCsA+雷紅沖劑組2.48±0.02 2.89±0.01 1.16±0.01 2.21±0.03c0.26±0.08c10.1±3.09c

2.2 家兔髂動(dòng)脈28 d后掃描電鏡 裸支架組新生血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞排列相對(duì)紊亂，細(xì)胞的大小不一致，形態(tài)不一，細(xì)胞核不規(guī)則，細(xì)胞間隙較大(圖1)。雷紅沖劑組的血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞排列與裸支架組比較較規(guī)則、細(xì)胞的大小、形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞間隙等，明顯好于裸支架組(圖2)。環(huán)孢素組的新生血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞排列較規(guī)整、緊密，排列方向接近血流方向，細(xì)胞間隙較小，血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、大小相對(duì)一致，細(xì)胞核較規(guī)則，接近正常細(xì)胞間隙。血管內(nèi)皮細(xì)胞比較接近正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞表面可見較多散在微絨毛結(jié)構(gòu)(圖3)。CSA加雷紅沖劑組的新生血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞排列、細(xì)胞的大小、形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞間隙等，與CSA組大致相仿，但微絨毛結(jié)構(gòu)沿細(xì)胞形態(tài)分布，而且分布更均勻說明細(xì)胞功能更接近正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖4)。

圖1 裸支架組掃描電鏡（×2000）

圖2 雷紅沖劑組掃描電鏡（×2000）

圖3 CsA組掃描電鏡（×2000）

圖4 CsA組加雷紅沖劑組電鏡掃描電鏡（×2000）

2.3 家兔髂動(dòng)脈組織切片對(duì)PCNA、p21Cip1 蛋白表達(dá)的影響28 d后各組實(shí)驗(yàn)家兔植入血管內(nèi)支架髂動(dòng)脈組織切片對(duì)PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響結(jié)果見表2，各對(duì)比組家兔多個(gè)均數(shù)的比較單因素方差分析P值結(jié)果見表4。雷紅沖劑組、CSA組及CSA加雷紅沖劑組具有抑制PCNA蛋白表達(dá)、抑制CDK2蛋白表達(dá)、抑制VEGF蛋白表達(dá)、增加VSMC的p21Cip1蛋白表達(dá)的趨勢(shì)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組家兔植入血管內(nèi)支架髂動(dòng)脈組織切片對(duì)PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響的結(jié)果()

表2 各實(shí)驗(yàn)組家兔植入血管內(nèi)支架髂動(dòng)脈組織切片對(duì)PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響的結(jié)果()

注：裸支架組與CsA組比較，aP＜0.001；裸支架組與雷紅沖劑組比較，bP＜0.001；裸支架組與CsA+雷紅沖劑組比較，cP＜0.001

組別裸支架組雷紅沖劑組CsA CsA加雷紅沖劑組例數(shù)(n) 6 6 6 6 PCNA 0.0906±0.0066 0.0566±0.0180 0.0319±0.0066 0.0306±0.0985 VEGF 0.0442±0.0178 0.0294±0.0119 0.0100±0.0026 0.0100±0.0019 CDK2 0.0690±0.0019 0.0409±0.0074 0.0319±0.0078 0.0305±0.0077c p21Cip1 0.0198±0.0034 0.0493±0.0127a0.0869±0.0076b0.0819±0.0056c

2.4 雷紅沖劑對(duì)患者血漿中IL-10、IL-18水平及下肢動(dòng)脈IMT的影響 雷紅沖劑組IL-10、IL-18水平及IMT厚度均明顯低于對(duì)照組，見表3。

2.5 雷紅沖劑對(duì)血管通暢率的影響 兩組腔內(nèi)治療成功率分別為98%和100%，血管通暢率隨時(shí)間延長(zhǎng)有不同程度的減低，對(duì)照組明顯減低，雷紅沖劑組無(wú)明顯變化。隨訪24周，對(duì)照組的血管通暢率明顯低于雷紅沖劑組（P＜0.05）。見表4。

表3 雷紅沖劑對(duì)患者血漿IL-10、IL-18水平及下肢動(dòng)脈IMT的影響(,n=40)

表3 雷紅沖劑對(duì)患者血漿IL-10、IL-18水平及下肢動(dòng)脈IMT的影響(,n=40)

注：與對(duì)照組同期比較,aP＜0.01;與本組術(shù)前比較,bP＜0.01

組別對(duì)照組術(shù)前術(shù)后4周術(shù)后12周術(shù)后24周雷紅沖劑組術(shù)前術(shù)后4周術(shù)后12周術(shù)后24周I L-10(pg/mL)I L-18(pg/mL)IMT(mm) 20.5±8.3 33.6±11.8b30.3±13.1 27.7±12.3 42.5±11.6 68.9±12.3b60.9±11.8 55.6±13.0 1.08±0.22 1.19±0.18b1.21±0.20 1.19±0.23 20.8±8.1 23.9±7.2a22.6±8.6a21.9±8.9a41.9±12.2 46.7±12.8a44.5±13.1a42.9±12.2a1.09±0.24 1.09±0.18a1.10±0.16a1.08±0.15a

表4 雷紅沖劑不同時(shí)間對(duì)患者血管通暢率的影響(n,%)

3 討論

3.1 免疫排斥反應(yīng)對(duì) ISR形成過程的影響ISR是多因素共同作用的結(jié)果，已有學(xué)者們提出了多種學(xué)說[3-4]，包括早期的血管彈性回縮、血小板聚集和附壁血栓形成、損傷血管局部炎癥細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)、新生內(nèi)膜增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管壁的重塑等，但確切的因果關(guān)系尚未確定。本實(shí)驗(yàn)從家兔血管內(nèi)支架植入術(shù)后家兔髂動(dòng)脈狹窄血管造影定量分析、血管內(nèi)支架植入家兔髂動(dòng)脈28 d后掃描電鏡比較、家兔血管內(nèi)支架髂動(dòng)脈組織切片對(duì)PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表達(dá)影響等方面研究證明，CSA、雷紅沖劑可以抑制細(xì)胞增殖的DNA合成、抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期染色體DNA的復(fù)制、抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期染色體DNA的復(fù)制、抑制免疫排斥反應(yīng)的加重和炎細(xì)胞的浸潤(rùn)程度的增強(qiáng)、抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程及引起細(xì)胞G l、G2甚至S期的阻滯，進(jìn)而推測(cè)CSA、雷紅沖劑可以抑制及減緩ISR的發(fā)生。免疫抑制劑可有效預(yù)防家兔髂動(dòng)脈血管內(nèi)支架早期再狹窄，免疫抑制劑與雷紅沖劑合用效果更佳。結(jié)果表明，免疫排斥反應(yīng)參與了ISR形成過程，免疫排斥反應(yīng)可能為引發(fā)ISR的重要機(jī)制之一。

3.2 雷紅沖劑對(duì)ISR形成過程的影響 有文獻(xiàn)報(bào)，道雷公藤、紅花、甘草具有抗炎及免疫抑制作用[5]。本研究結(jié)果表明，雷紅沖劑組血管內(nèi)膜表面血管內(nèi)皮細(xì)胞排列較裸支架組規(guī)則，細(xì)胞的大小、形態(tài)、細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞間隙及血管通暢率等均明顯好于裸支架組，雷紅沖劑具有抑制PCNA蛋白表達(dá)、CDK2蛋白表達(dá)、VEGF蛋白表達(dá)及增加VSMC的p21Cip1蛋白表達(dá)的作用。說明雷紅沖劑對(duì)ISR形成過程具有抑制作用。

3.3 雷紅沖劑對(duì)下肢動(dòng)脈腔內(nèi)治療后血管支架內(nèi)再狹窄的作用 腔內(nèi)治療是目前下肢動(dòng)脈閉塞性疾病的首選方法[6]。腔內(nèi)治療3年的通暢率在50%～70%范圍，糖尿病性下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的通暢率在42%～61%。腔內(nèi)治療后再狹窄或閉塞是目前血管外科急需解決的臨床難題之一，而血管內(nèi)膜增生是腔內(nèi)治療術(shù)后再狹窄的特征性病理改變[7]。病變血管的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖并向內(nèi)膜遷移是新生內(nèi)膜增生的重要病理基礎(chǔ)，是各種因素導(dǎo)致血管再通術(shù)后血管再狹窄的關(guān)鍵病理改變[8]。本文的臨床觀察結(jié)果表明，對(duì)照組腔內(nèi)治療后3個(gè)月后病變血管的通暢率降至72%，雷紅沖劑治療組為90%，雷紅沖劑治療組血漿中IL-10、IL-18的水平及IMT厚度均明顯低于對(duì)照組，服藥期間無(wú)明顯不良反應(yīng)。說明雷紅沖劑對(duì)ISR形成過程具有抑制作用，有望作為干預(yù)下肢動(dòng)脈腔內(nèi)治療后血管支架內(nèi)再狹窄的藥物。

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（收稿：2012-11-16 修回：2013-06-26）

（責(zé)任編輯 趙連根）

Effects of LeiHong（雷紅）Granuleson Endovascular Treatment of Vascular Restenosis

HAN Bing,GE Chang-qing,ZHANG Hong-guang,et al. Department of Vascular Surgery,The Second Haspital of Baoding City,Baoding(071051),China

ObjectiveTo investigate the immune rejection involved in the formative process of intravascu?lar stent restenosis(ISR),and to observe the therapeutic effect of LeiHong granules（雷紅沖劑）on in-stent reste?nosis of lower limb artery.MethodsTwenty-four healthy New Zealand white rabbits were implanted the met?al endovascular stent in the iliac arterys and were randomly divided into 4 groups:A:bare metal stent,B:Cyclo?sporin A(CSA),C:LeiHong capsule（雷紅沖劑）,and D:CSA and LeiHong capsule（雷紅沖劑）,the vessel diam?eter was recorded before the stent implantation,right after the implantation and 28 days later,with immunohisto?chemical staining and electronic microscopic observation,Eighty patients with lower extremity arterial occlusive disease were randomly divided into LeiHong（雷紅）treatment group and control group with observation on changes of inflammation factors and vascular patency at different times.ResultsRabbit iliac artery ste?nosis rates were 51.4±1.69%（A），10.9±0.71%（B），21.3±1.89%（C）and 10.1±3.09%（D）.The patency rate of the lower extremity vessels in LeiHong granules（雷紅沖劑）group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05),and the levels of IL-10,IL-18 and IMT in LeiHong granules（雷紅沖劑）group were significantly lower(P＜0.01).ConclusionThe vascular in-stent restenosis can be intervened and inhibited by immuno?suppressants CSA and LeiHong granules（雷紅沖劑）Immune rejection was one of the important causes for form?ing ISR propably.LeiHong granules（雷紅沖劑）can effectively prevent from restenosis after endovascular treat?ment.

Immune rejection;in-stent restenosis;LeiHong granules（雷紅沖劑）

Q95-33;R258.5

A

1007-6948(2013)05-0530-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.014

1.河北省保定市第二醫(yī)院血管外科（保定 071051）

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院周圍血管病科（哈爾濱 150000）

韓 冰，E-mail：hanbingmd@163.com