李 蔚，張慧霞，樊紅琨，段芳齡，馬 軍

1．鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南鄭州450001;2．鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;3．鄭州大學(xué)消化疾病研究所

近年發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可向肝系細(xì)胞分化，成為臨床上進(jìn)行肝系細(xì)胞移植治療肝臟疾病的潛在種子細(xì)胞。本課題在體外用HGF+FGF-4培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化，運(yùn)用微陣列技術(shù)對(duì)分化過程中的基因表達(dá)譜進(jìn)行篩選，分析發(fā)生表達(dá)變化的基因，以期了解與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化相關(guān)的基因及它們之間的相互關(guān)系，揭示人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 hMSCs的分離和培養(yǎng) 健康志愿成人胸骨穿刺無菌抽取骨髓2～4 ml，重懸于等量PBS中;將稀釋后的骨髓細(xì)胞疊加到等體積的淋巴細(xì)胞分離液(密度1．077)，離心;沿管壁抽取含有MSCs的灰白色細(xì)胞層的全部細(xì)胞，分別用作細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫組化和抽提RNA，并留取部分細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的LDMEM培養(yǎng)基中，吹打成單細(xì)胞懸液，以2×105/cm2的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)。

3 d后首次換液，除去未貼壁細(xì)胞，更換新鮮的培養(yǎng)液，以后每3～4 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底90%融合時(shí)，用0．25%胰蛋白酶消化，胎牛血清終止，傳代培養(yǎng)。

1．2 hMSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng) 第3代hMSCs到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接種于鋪有鼠尾膠原處理爬片的24孔培養(yǎng)板中。改用含 5%FBS、1×ITS、4．7 μg/ml亞油酸、1 mg/ml BSA、5×10－9M/L地塞米松、10－4M/L抗壞血酸、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素以及10 ng/ ml EGF的DF培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入HGF(20 ng/ml)+ FGF4(15 ng/ml)。每4 d換液1次，37℃、5%CO2飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和糖原染色方法分別檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型和功能。

1．3 正常人肝細(xì)胞株L-02的培養(yǎng) 用不含生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基把正常肝細(xì)胞株接種到預(yù)鋪有鼠尾膠原的25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，接種密度為3×105/ml。常規(guī)培養(yǎng)和換液。

1．4 肝系細(xì)胞的分析和鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè):留取的細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛室溫固定;0．3%TritonX-100處理;過氧化物酶阻斷溶液室溫下孵育;滴加正常山羊血清封閉液;加一抗:CK18工作液、AFP工作液、白蛋白工作液，4℃過夜;加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min;加過氧化物酶標(biāo)記的卵白素;加新配制的DAB顯色5～10 min;蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

PAS染色:留取的細(xì)胞爬片分別用Carnoy固定液固定10 min;1%過碘酸水溶液反應(yīng)10 min;Schiff試劑反應(yīng)30 min;2%甲基綠復(fù)染20 min;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

RT-PCR:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝系細(xì)胞中的白蛋白，TRIZOL法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用Oligo 6．0軟件設(shè)計(jì)引物并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體如下:

引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度退火溫度ALB 5'-TGCAAGAA TGTGCTGATGATGACAGGG-3'，162 bp 58℃，5'-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3'，GAPDH:5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，500 bp 58℃，5'-CAAAG TTGTCATGGATGGACC-3'，PCR反應(yīng)體系 10×buffer 2．5 μl，Taq酶0．125 μl，dNTPs(10 mmol/L)0．5 μl，上游引物(276．5 pmol/L)0．27 μl，下游引物(271．5 pmol/L)0．276 μl，cDNA模板1 μl，去離子水20．329 μl，總體積 25 μl。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性3 min→94℃變性30 s→58℃退火30 s→72℃延伸45 s，總共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸3 min。

1．5 PCR結(jié)果的判定 分別取PCR產(chǎn)物5 μl上樣，6 μl DNA ladder作參照。用1．5%瓊脂糖跑電泳，紫外投射儀下觀察。

1．6 微陣列分析 取誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d的細(xì)胞和未誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)，采用H-80S基因表達(dá)譜芯片(上海博星生物芯片有限公司協(xié)助完成)。其實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方法如下:

苯酚氯仿試劑盒抽提誘導(dǎo)細(xì)胞和未誘導(dǎo)細(xì)胞總RNA，熒光標(biāo)記(CY5標(biāo)記誘導(dǎo)細(xì)胞，CY3標(biāo)記未誘導(dǎo)細(xì)胞，后者作對(duì)照組)，cDNA芯片的制作和基因雜交。ScanArray4000掃描儀(美國(guó)packard公司)掃描芯片，圖像處理軟件:Genepix Pro 3．0圖像處理軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，經(jīng)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化。以Cy3和Cy5的比值＞2或＜0．5，Cy3和Cy5均＞200或其中之一＞800，認(rèn)為基因表達(dá)有差異。1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，以α=0．05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) 新鮮分離的骨髓細(xì)胞性狀良好。培養(yǎng)3周左右骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接近融合，細(xì)胞排列成旋渦狀或輻射狀，胞體中央膨大為扁圓形的細(xì)胞核，可見1～2個(gè)核仁(見圖1)。

2．2 誘導(dǎo)培養(yǎng)后肝系細(xì)胞的鑒定

2．2．1 AFP免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:AFP細(xì)胞誘導(dǎo)0 d時(shí)未見表達(dá)。誘導(dǎo)7 d時(shí)AFP高表達(dá)，14 d時(shí)AFP表達(dá)率降低(P＜0．05)，21 d及28 d時(shí)AFP為陰性。不加一抗對(duì)照為陰性結(jié)果(見圖2)。

2．2．2 CK18免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:CK18在細(xì)胞誘導(dǎo)0 d時(shí)未見表達(dá)。誘導(dǎo)7 d時(shí)有少數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)率逐漸增高(P＜0．05)。不加一抗對(duì)照為陰性結(jié)果(見圖3)。

2．2．3 白蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:白蛋白在細(xì)胞誘導(dǎo)0 d時(shí)未見表達(dá)。誘導(dǎo)7 d時(shí)有少數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)率逐漸增高(P＜0．05)。不加一抗對(duì)照為陰性結(jié)果(見圖4)。

2．2．4 PAS糖原染色結(jié)果:細(xì)胞誘導(dǎo)0 d、7 d時(shí)糖原染色結(jié)果為陰性，誘導(dǎo)14 d時(shí)開始有少數(shù)細(xì)胞糖原染色為陽性，21 d、28 d時(shí)表達(dá)率逐漸增高(P＜0．05，見圖5)。

2．2．5 白蛋白R(shí)T-PCR結(jié)果:細(xì)胞培養(yǎng)0周白蛋白mRNA為陰性表達(dá)，1、2、3、4周均為陽性表達(dá)，且表達(dá)程度逐漸增高(見圖6)。

2．3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和肝系細(xì)胞的基因表達(dá)差異分析 結(jié)果顯示121條基因表達(dá)發(fā)生變化，其中89條基因上調(diào)，32條基因下調(diào)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HGF、FGF4誘導(dǎo)人MSCs向肝系細(xì)胞分化，所誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)肝系細(xì)胞特異性表面標(biāo)志并具有肝臟合成糖原的功能，有望成為干細(xì)胞為基礎(chǔ)的肝臟疾病治療的種子細(xì)胞。

微陣列技術(shù)以其高度信息集約化、平行化以及高效、快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，被推廣運(yùn)用于基因表達(dá)譜、疾病診斷、藥物篩選、新基因?qū)ふ?、基因分型、基因突變等領(lǐng)域［1］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用微陣列技術(shù)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究和篩選，分析表達(dá)變化的基因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，121條基因表達(dá)發(fā)生了變化，其中89條基因上調(diào)，32條基因下調(diào)。這些基因涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯與合成等。由于肝臟在物質(zhì)代謝中具有重要作用，我們認(rèn)為血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(serum and glucocorticoid regulated protein kinase，SGK)等可能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化過程中有重要意義。

圖6 培養(yǎng)不同時(shí)間人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中白蛋白核糖核酸的表達(dá) M:Marker;0:培養(yǎng)0周;1:培養(yǎng)1周;2:培養(yǎng)2周;3:培養(yǎng)3周;4:培養(yǎng)4周;陽:陽性對(duì)照Fig 6 Expression of album in RNA in hMSCs cultured 0～4 weeks M:Marker;0:cultured 0 week;1:cultured 1 week;2: cultured 2 weeks;3:cultured 3 weeks 4:cultured 4 weeks;Positive:positive control

SGK基因:研究表明，SGK可能是多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)功能性交匯點(diǎn)［2-3］，在調(diào)節(jié)離子通道、細(xì)胞存活和凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。

SGK受多種生長(zhǎng)因子刺激激活而促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡。在人乳腺上皮細(xì)胞中激活糖皮質(zhì)激素受體，能夠迅速誘導(dǎo)SGK，從而啟動(dòng)一個(gè)抗凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑;而在無生長(zhǎng)因子作用下，異常的SGK表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡。而喪失激酶活性的SGK在細(xì)胞中表達(dá)，拮抗糖皮質(zhì)激素受體激活導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SGK是糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的細(xì)胞存活信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要的下游應(yīng)答底物。其快速敏捷的轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控使其與其他細(xì)胞存活激酶相比具有明顯區(qū)別［4］。

SGK可經(jīng)HGF刺激激活而促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡。Shelly等［5］利用表皮細(xì)胞系MDCK細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HGF能夠激活SGK基因，而且認(rèn)為SGK的活化可以通過涉及到細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來完成。我們的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含有生長(zhǎng)因子HGF+FGF4的DMEM-F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，并證實(shí)已分化細(xì)胞具有肝系細(xì)胞特征，而且SGK基因在我們的實(shí)驗(yàn)中明顯上調(diào)，因此本實(shí)驗(yàn)表明SGK基因可能在該培養(yǎng)體系誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中，因HGF的作用而被激活，從而在維持細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖方面起重要作用，為實(shí)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化提供了重要的前提條件。

圖7 2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)細(xì)胞和未誘導(dǎo)細(xì)胞雜交信號(hào)強(qiáng)度散點(diǎn)圖Fig 7 Hybridization signal intensity scatter diagram between the experiment group and the control group through tw ice repeated experiment

ApoB:ApoB是LDL受體的配體，其負(fù)責(zé)LDL在體內(nèi)的清理、參與VLDL的合成分泌、向組織運(yùn)輸脂類和膽固醇等。脂類被用于代謝或儲(chǔ)存;膽固醇被用于細(xì)胞膜的合成更新及類固醇的合成等。

LDLR基因:低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)是一種細(xì)胞表面蛋白，是低密度脂蛋白受體基因家族中最重要的一種，對(duì)于調(diào)節(jié)膽固醇的體內(nèi)平衡、調(diào)節(jié)血漿總膽固醇濃度起關(guān)鍵性的作用。

CETP:CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)為疏水性糖蛋白，由17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和476個(gè)氨基酸的多肽組成，疏水性氨基酸占44%。人的肝臟、小腸等組織含有CETP mRNA。在脂蛋白代謝中，CETP介導(dǎo)脂蛋白之間脂質(zhì)的交換，協(xié)調(diào)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SGK基因在HGF +FGF4作用下被激活，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、維持細(xì)胞的存活，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從而為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化提供前提保證。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化過程中，與肝細(xì)胞功能有關(guān)的基因逐漸表達(dá)出來，如有關(guān)脂質(zhì)和膽固醇代謝的基因ApoB、LDLR和CETP，進(jìn)一步完善肝細(xì)胞的功能。

［1］Lockhart DJ，Winzeler EA．Genomics，gene experssion and DNA arrays［J］．Nature，2000，405(6788):827-836．

［2］Park J，Leong ML，Buse P，et al．Serum and glucocorticoid-inducible kinase(SGK)is a target of the PI3-kinase-stimulated signaling pahtway［J］．EMBO J，1999，18(11):3024-3033．

［3］Klaus F，Palmada M，Lindner R，et al．Up-regulation of hyperto-nicityactivatedmyo-inositol transporter SMIT1by the cell vol-umesensitive protein kinase SGK1［J］．J Physiol，2008，586(6):1539．

［4］Mikosz CA，Brickley DR，Sharkey MS，et al．Glucocorticoid receptormediated protection from apoptosis is associated with induction of the serine/threonine survival kinase gene，sgk-1［J］．J Biol Chem，2001，276(20):16649-16654．

［5］Shelly C，Herrera R．Activation of SGK1 by HGF，Rac1 and integrinmediated cell adhesion in MDCK cells:PI-3K-dependent and-independent pathways［J］．J Cell Sci，2002，115(Pt 9):1985-1993．