胡 毅，丁 玲，周 鋼，鄒勝智

重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 402260

大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤(laterally spreading tumor，LST)首先由日本學(xué)者工藤進(jìn)英博士提出。此種腫瘤因其極少向腸壁深層垂直侵犯，而主要沿黏膜表面呈側(cè)向淺表擴(kuò)散，故稱之為側(cè)向發(fā)育型腫瘤[1]。LST的病變形態(tài)及發(fā)生、發(fā)展規(guī)律不同于一般的腺瘤，有其特殊性。國內(nèi)外研究均表明，LST存在較高程度的惡變風(fēng)險，因此應(yīng)及早診斷并行內(nèi)鏡下治療[2]。而有關(guān)LST的生物學(xué)特殊性及其與大腸癌關(guān)系的具體分子機(jī)制目前仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是 TGF-β超家族的主要成員，大量研究表明，它與腫瘤關(guān)系密切，在腫瘤產(chǎn)生初始階段，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖及促凋亡作用，而在腫瘤進(jìn)展期，則有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用[3]。目前尚未見TGF-β1在LST表達(dá)情況的報道，本研究將觀察LST中TGF-β1基因及蛋白表達(dá)水平，并與腺瘤性息肉及大腸癌進(jìn)行比較，初步探討LST發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例及標(biāo)本 12例大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤、12例腺瘤性息肉組織及正常大腸黏膜組織均來自重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院2010年5月－2012年3月的內(nèi)鏡下手術(shù)標(biāo)本。16例大腸癌組織來自重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院2011年5月－2011年11月的外科手術(shù)標(biāo)本。所有標(biāo)本均于－80℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 PCR儀為美國Thermo公司產(chǎn)品。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成，凝膠成像系統(tǒng)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。TGF-β1兔抗人單克隆一抗購自SantaCruz生物技術(shù)公司，β-actin兔抗人單克隆一抗及相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自武漢博士德公司，蛋白裂解液和ECL發(fā)光試劑盒購自Sigma公司。

1.3 qRT-PCR法檢測TGF-β1 mRNA表達(dá)情況參照試劑盒說明提取組織中的總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增反應(yīng)。TGF-β1引物:Sense 5'-TGCAGCTACCCCGTTAGCT-3'，antisense 5'-AGCAGTGCAAATTACTGG-3'。β-actin 引物:Sense 5'-GTCAATGACTCGAGGCCA-3'，antisense 5'-TACTTCGTCGAAGCACAA-3'。循環(huán)擴(kuò)增條件為:在93℃ 2 min進(jìn)行預(yù)變性;循環(huán)40個周期，順次包括93℃ 60 s，55℃ 60 s以及72℃ 20 s;最后在72℃條件下延伸7 min。TGF-β1擴(kuò)增產(chǎn)物長度為169 bp。每個樣品均重復(fù)檢測3次。采用2ΔCt法計(jì)算TGF-β1 相對表達(dá)量(ΔCt=TGF-β1 Ct-β-actin Ct)[4]。

1.4 Western blotting法檢測 TGF-β1蛋白表達(dá)水平將組織勻漿后提取總蛋白，BCA法測定總蛋白含量，取各組總蛋白，每管中加入×5上樣緩沖液6 μl，再加去離子水調(diào)整待測樣本體積為30 μl，分別在80 V及120 V電壓條件下行蛋白濃縮及分離。SDS-PAGE 80 min，恒流200 mA，冰上轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入單抗(稀釋度1∶750)和β-actin單抗(稀釋度1∶3000)，混懸轉(zhuǎn)動2～3 h，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次20 min，加入二抗(稀釋度1∶1000)，混懸轉(zhuǎn)動2 h，TBST漂洗3次，每次20 min。ECL顯影，暗室膠片曝光、洗片。凝膠定量軟件Quantity One分析各條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參照計(jì)算各組蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 mRNA 在腺瘤性息肉、LST 及大腸癌組織中的表達(dá) 在腺瘤性息肉、LST及大腸癌組織中TGF-β1 mRNA平均相對表達(dá)量分別為0.01519±0.000421、0.01723 ± 0.000385 和 0.01882 ±0.000450。結(jié)果顯示，LST中TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著高于腺瘤性息肉，而明顯低于大腸癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均 ＜0.01，見圖1)。

2.2 TGF-β1蛋白在正常大腸黏膜、腺瘤性息肉、LST及大腸癌組織中的表達(dá) TGF-β1在正常腸黏膜及腺瘤性息肉組織中幾乎不表達(dá)，而在大腸癌組織表達(dá)量顯著升高。LST組織中的TGF-β1蛋白表達(dá)量比正常腸黏膜及腺瘤性息肉升高(P均＜0.05)，但明顯低于大腸癌組織(P ＜0.01，見圖2、3)。

3 討論

LST作為一種形態(tài)特殊的大腸腫瘤，與傳統(tǒng)意義上的大腸腺瘤明顯不同，得到了全球?qū)W者的廣泛關(guān)注。但目前對于LST的研究仍主要集中在內(nèi)鏡下的診斷及治療方面[5-6]，而對其可能具有的較為獨(dú)特的發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制研究仍十分缺乏。國內(nèi)學(xué)者姜泊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號途徑在LST發(fā)生發(fā)展過程中有明顯活化現(xiàn)象，且可能與部分關(guān)鍵分子的磷酸化失活有關(guān)，揭示了LST比大腸腺瘤更具有惡變傾向的可能分子機(jī)制。

TGF-β1的生物學(xué)功能極其復(fù)雜，在多種組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管生成、細(xì)胞間相互作用、免疫反應(yīng)、間質(zhì)形成以及組織損傷修復(fù)等過程中起著關(guān)鍵性作用。近年來的大量研究表明，TGF-β1與腫瘤關(guān)系密切，可能在其發(fā)生和發(fā)展過程中起著雙重調(diào)節(jié)作用，即在癌變早期TGF-β1作為抑癌因子出現(xiàn)，而在腫瘤的進(jìn)展過程中可通過自分泌和(或)旁分泌途徑刺激腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[7]

本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR及Western bloting法分別從基因及蛋白水平對LST組織中TGF-β1表達(dá)情況進(jìn)行檢測，同時與腺瘤性息肉、大腸癌進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn):TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著高于腺瘤性息肉，而明顯低于大腸癌。TGF-β1蛋白在正常腸黏膜及腺瘤性息肉組織中幾乎不表達(dá)，而在大腸癌組織表達(dá)量顯著提高。LST中的TGF-β1蛋白表達(dá)量比正常腸黏膜及腺瘤性息肉升高，但明顯低于大腸癌組織。上述結(jié)果從分子水平進(jìn)一步解釋了LST的特殊性，亦提示LST可能比普通腺瘤性息肉更具有惡變傾向。因此，TGF-β1有望成為預(yù)判LST惡變傾向的重要指標(biāo)。

TGF-β1需要與其相應(yīng)受體結(jié)合并通過Smads蛋白發(fā)揮具體生物學(xué)效應(yīng)，因此有關(guān)TGF-β1在LST發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究。另外本課題樣本數(shù)量有限，在一定程度上影響了結(jié)果的可靠性，今后仍需在擴(kuò)大樣本量基礎(chǔ)上作更為深入的研究。

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