許弘飛，孟林，姚健，谷振勇，劉國(guó)慶，沈憶文，趙子琴

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2.南通通大化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)中心，江蘇南通 226001；3.南通市公安局刑警支隊(duì)，江蘇南通 226001；4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇南通 226001；5.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

Spry1和MAPK蛋白在病毒性心肌炎心肌組織中的表達(dá)

許弘飛1，2，孟林3，姚健3，谷振勇4，劉國(guó)慶4，沈憶文5，趙子琴5

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2.南通通大化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)中心，江蘇南通 226001；3.南通市公安局刑警支隊(duì)，江蘇南通 226001；4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江蘇南通 226001；5.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

目的通過探討Spry1和MAPK蛋白在病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）心肌組織中的表達(dá)，揭示其發(fā)病及猝死機(jī)制，并為法醫(yī)學(xué)心源性猝死的鑒定提供指導(dǎo)。方法30只Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為VMC組和對(duì)照組，分別腹腔注射柯薩奇B3病毒和Eagel’s培養(yǎng)液，處死小鼠取心臟，進(jìn)行常規(guī)病理檢查，并通過免疫組織化學(xué)、Western印跡法及real-time PCR方法檢測(cè)心肌組織中Spry1蛋白及mRNA、MAPK蛋白表達(dá)變化。結(jié)果VMC組在光鏡下可見心肌間質(zhì)水腫，廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞壞死，心肌纖維形成多處灶性、大片狀壞死，心肌組織中Spry1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），Spry1 mRNA水平略降低（P＞0.05）；而MAPK蛋白表達(dá)水平在VMC組高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論Spry1參與的MAPK/ERK通路在病毒性心肌炎心肌纖維化過程中起著促進(jìn)膠原表達(dá)的作用，從而導(dǎo)致心律失常、心功能減退甚至心源性猝死。關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；猝死，心臟；病毒性心肌炎；Spry蛋白；MAPK蛋白

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是目前嚴(yán)重威脅人類生命健康的最常見的心血管疾病之一，其猝死率列心源性猝死的第三位，僅次于冠心病和高血壓病[1]。在青壯年中，由心肌炎所致的猝死率高達(dá)17%～21%，兒童患VMC預(yù)后較差，病死率更可高達(dá)50%[2]，近年來VMC發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。雖然國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者從病因、病理變化、發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)調(diào)查、臨床治療及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面對(duì)其進(jìn)行過較多研究，但該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理組織形態(tài)改變無特異性，前期癥狀不明顯，猝死率較高。本研究旨在通過探討Spry1、MAPK蛋白在VMC心肌中的表達(dá)情況，揭示VMC發(fā)病及猝死機(jī)制，并為法醫(yī)學(xué)心源性猝死的鑒定提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

30只純種Balb/c小鼠（4周齡，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量12～16 g），由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部提供，并飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部SPF級(jí)環(huán)境中。

1.2 病毒

柯薩奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）Nancy株，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，在Hela細(xì)胞中傳代，凍融、離心3次，上清液分裝，在Hela細(xì)胞測(cè)50%組織感染率（50% tissue culture infective dose，TCID50）為107，-70℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)用病毒量為1×105TCID50。

1.3 主要試劑

Spry1抗體（兔抗，美國(guó)Abcam公司），MAPK抗體（兔抗，美國(guó)Millipore公司），PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）。

1.4 動(dòng)物模型制作

隨機(jī)選取10只小鼠，腹腔注射不含病毒的Eagel’s培養(yǎng)液（EMEM）作為對(duì)照組；其余20只小鼠按文獻(xiàn)[3]方法腹腔內(nèi)無菌注射0.1mL CVB3（1×105TCID50）制作急性病毒性心肌炎動(dòng)物模型作為VMC組。

定義 11 設(shè)(U,A∪D)是一個(gè)覆蓋決策系統(tǒng),U/D={k=1,2,…,l}, B?A。如果RSθ,η(B,D)?RSθ,η(A,D),B稱為(U,A∪D)的規(guī)則蘊(yùn)含關(guān)系保持的一致集;否則稱其為(U,A∪D)的規(guī)則蘊(yùn)含關(guān)系保持的不一致集。如果RSθ,η(B,D)?RSθ,η(A,D)且對(duì)?B有RSθ,η(B{a},D)?/ RSθ,η(A,D),那么B稱為(U,A∪D)的一個(gè)規(guī)則蘊(yùn)含關(guān)系保持的約簡(jiǎn)。所有的約簡(jiǎn)記為所有約簡(jiǎn)的交集稱為(U,A∪D)的核,并記為

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 組織取材及切片制備

將上述動(dòng)物于7d后腹腔注射戊巴比妥（40mg/kg）后處死并取出心臟。心臟瓣膜下取小塊左、右心室組織做組織學(xué)分析，固定在4%pH為7.2的多聚甲醛緩沖液中固定并包埋，切片后進(jìn)行HE染色。剩余的左、右心室組織在液氮中冰凍保存。

1.5.2 Western印跡法分析

組織先用勻漿器碾碎后，用RIPA裂解液提取組織蛋白質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）測(cè)濃度。取100g組織，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用第二抗體偶聯(lián)物進(jìn)行免疫檢測(cè)，發(fā)光底物顯跡法進(jìn)行顯跡，經(jīng)顯影、定影后分析雜交信號(hào)，并以同一張膜上重復(fù)雜交，GAPDH作為對(duì)照，用1D凝膠分析軟件Quantity one（美國(guó)Bio-Rad公司）分析結(jié)果。

1.5.3 Real-time PCR檢測(cè)

采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司）抽提心肌組織總RNA，獲得的RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行合成cDNA。按PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進(jìn)行RNA擴(kuò)增，Spry1（NM_011896）引物序列正向：5′-ACCCTTCCTGTGTTTTCAT-3′和反向：5′-AGTCACCTTGCTTTTCTTG-3′；內(nèi)參照基因GAPDH引物序列正向：5′-CTGACATGCCGCCTGGA GA-3′和反向：5′-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′。PCR反應(yīng)采用二步法，具體條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)；最后4℃保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌組織HE染色

VMC組在光鏡下可見小鼠心肌間質(zhì)水腫，廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞壞死，心肌纖維崩解、斷裂，形成多處灶性、大片狀壞死（圖1）。

圖1 VMC組與對(duì)照組心肌組織HE染色

2.2 心肌組織Spry1蛋白Western印跡法結(jié)果及mRNA改變

通過Western印跡法對(duì)Spry1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VMC組小鼠腹腔注射病毒后7 d，Spry1蛋白陽性表達(dá)較GAPDH明顯降低，而在對(duì)照組中，Spry1蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生改變（圖2）。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，VMC組Spry1蛋白水平較對(duì)照組降低（P<0.05），而mRNA水平無明顯變化（P＞0.05，表1）。

圖2 Spry1蛋白電泳結(jié)果

表1 兩組Spry1、MAPK蛋白表達(dá)量（±s）

表1 兩組Spry1、MAPK蛋白表達(dá)量（±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別例數(shù)Spry1蛋白Spry1 mRNAMAPK蛋白對(duì)照1011.964±1.8721.211±0.3398.083±1.274 VMC203.181±1.1051）1.016±0.499 25.012±1.8101）

2.3 心肌組織MAPK蛋白Western印跡法結(jié)果

以電泳條帶上GAPDH（相對(duì)分子質(zhì)量36 000）為標(biāo)志，各組Western印跡法電泳均可顯示在相對(duì)分子質(zhì)量38000范圍的條帶，VMC組MAPK顯色較GAPDH增強(qiáng)（圖3）。VMC組左室心肌組織MAPK蛋白相對(duì)含量較對(duì)照組增多（P＜0.05，表1）。

圖3 MAPK蛋白電泳結(jié)果圖

3 討論

心肌纖維化是心肌間質(zhì)中膠原過度沉積的結(jié)果，心肌膠原含量顯著升高或膠原容積積分顯著高于正常值，是病毒性心肌炎慢性期的主要病理變化。近年來認(rèn)識(shí)到病毒性心肌炎心肌纖維化可以影響病程和預(yù)后，是心臟疾病出現(xiàn)心律失常、心功能減退甚至心源性猝死的重要原因[4]。

細(xì)胞外基質(zhì)是心肌間質(zhì)的主要成分，主動(dòng)參與心肌重構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)主要由成纖維細(xì)胞分泌的膠原蛋白構(gòu)成，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維是正常及病理心肌間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的主要成分[5]。病理性心肌重塑時(shí)，實(shí)質(zhì)與間質(zhì)不成比例增生（后者增多）是引起心功能由代償轉(zhuǎn)向失代償及心衰的重要原因之一。Li等[6]采用Balb/c小鼠腹腔接種CVB3建立病毒性心肌炎模型，10d后心肌活檢發(fā)現(xiàn)CD3 T細(xì)胞大量浸潤(rùn)，腫瘤壞死因子α，白細(xì)胞介素1、4（IL-1、IL-4），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）表達(dá)增加，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成及Ⅰ/Ⅲ型膠原比值均明顯升高。

Spry基因家族成員作為纖維組織母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）誘發(fā)的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的抑制因子，可能具有抑制血管重建和腫瘤發(fā)生作用。研究[7-8]顯示，Spry1主要通過調(diào)節(jié)Ras-Raf-MEKMAPK傳導(dǎo)通路信號(hào)輸出的強(qiáng)度和時(shí)間，控制細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞的凋亡和存活。迄今為止，已有4種哺乳動(dòng)物的Spry基因被發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)上，Spry蛋白的富含半胱氨酸的C末端具有很強(qiáng)的保守性，是其定位于活化細(xì)胞胞膜上的靶區(qū)域[9-11]，而N末端存在較強(qiáng)的變異性。根據(jù)其序列差異，Spry蛋白分為4種亞型（Spry1、Spry2、Spry3、Spry4），Spry1對(duì)MAPK信號(hào)途徑的抑制作用顯著高于其他亞型。由于其顯著的生物學(xué)效應(yīng)，Spry1成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

研究[12]表明，MAPK信號(hào)通路負(fù)責(zé)將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為。細(xì)胞內(nèi)MAPK的活化受到多種因素嚴(yán)密調(diào)控，Spry1是FGF及EGF等受體酪氨酸激酶（RTK）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[13]，通過負(fù)反饋機(jī)制抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，從而遏制生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移及分化。Spry1基因在前列腺癌、乳癌及惡性膠質(zhì)瘤中受抑制或沉默，因此被視為抑制MAPK-ERK通路的抑癌基因[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過Western印跡法檢測(cè)VMC組心肌組織Spry1蛋白電泳結(jié)果較對(duì)照組顯色減弱，MAPK蛋白相對(duì)含量較對(duì)照組顯色增強(qiáng)；real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，VMC組Spry1的mRNA水平與對(duì)照組無明顯變化（P＞0.05），而MAPK蛋白相對(duì)含量較對(duì)照組增多（P＜0.05）。

Hoshijima等[16]認(rèn)為，在心衰的進(jìn)展中，存在雙階段的信號(hào)激活級(jí)聯(lián)，一是在壓力負(fù)荷或牽張的初期，與細(xì)胞生存或增生有關(guān)；二是在增生信號(hào)激活的同時(shí)也啟動(dòng)負(fù)反饋信號(hào)通路。在壓力負(fù)荷下，初期MAPK激活引起心肌肥大，以增加心功能，代償壓力負(fù)荷；而MAPK活性降低可能顯示心肌細(xì)胞增生、肥大能力減弱，心功能失代償導(dǎo)致心衰。本研究結(jié)果與此一致，Spry1參與的MAPK/ERK通路在病毒性心肌炎心肌纖維化過程中起著促進(jìn)膠原表達(dá)的作用，從而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生、心功能減退甚至心源性猝死。

[1]盧才義，高磊.老年人心臟性猝死的定義、流行病學(xué)及病因?qū)W[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2007，21（6）：363-365.

[2]Sliwa K，Damasceno A，Mayosi BM.Epidemiology and etiology of cardiomyopathy in Africa[J].Circulation，2005，112（23）：3577-3583.

[3]李雙杰，張召才，陳瑞珍，等.黃芪甲甙治療BALB/C小鼠CVB3病毒性心肌炎療效研究[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2004，17（5）：681-683.

[4]Heldin CH，Miyazono K，ten Dijke P.TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature，1997，390（6659）：465-471.

[5]Miner EC，Miller WL.A look between the cardiomyocytes：the extracellular matrix in heart failure[J].Mayo Clin Proc，2006，81（1）：71-76.

[6]Li J，Schwimmbeck PL，Tschope C，et al.Collagen degradation in a murine myocarditis model：relevance of matrix metalloproteinase in association with inflammatory induction[J].Cardiovasc Res，2002，56（2）：235-247.

[7]柴文戍，王洪梅，張書芹.銅綠假單胞菌通過MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)U937細(xì)胞表達(dá)IL-8[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（10）：1354-1358.

[8]Raabe T，Rapp UR.KSR—a regulator and scaffold protein of the MAPK pathway[J].Sci STKE，2002，(136)：pe28.

[9]Guy GR，Wong ES，Yusoff P，et al.Sprouty：how does the branch manager work?[J].J Cell Sci，2003，116（Pt 15）：3061-3068.

[10]Tefft D，Lee M，Smith S，et al.mSprouty2 inhibits FGF10-activated MAP kinase by differentially binding to upstream target proteins[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283（4）：L700-L706.

[11]Lim J，Yusoff P，Wong ES，et al.The cysteine-rich sprouty translocation domain targets mitogen-activated protein kinase inhibitory proteins to phosphatidylinos-itol 4，5-bisphosphate in plasma membranes[J].Mol Cell Biol，2002，22（22）：7953-7966.

[12]Murphy DA，Makonnen S，Lassoued W，et al.Inhibition of tumor endothelial ERK activation，angiogenesis，and tumor growth by sorafenib（BAY43-9006）[J].Am J Pathol，2006，169（5）：1875-1885.

[13]Cabrita MA，Christofori G.Sprouty proteins，masterminds of receptor tyrosine kinase signaling[J].Angiogenesis，2008，11（1）：53-62.

[14]Edwin F，Anderson K，Ying C，et al.Intermolecular interactions of Sprouty proteins and their implications in development and disease[J].Mol Pharmacol，2009，76（4）：679-691.

[15]Murphy T，Hori S，Sewell J，et al.Expression and functional role of negative signalling regulators in tumour development and progression[J].Int J Cancer，2010，127（11）：2491-2499.

[16]Hoshijima M，Chien KR.Mixed signals in heart failure：cancer rules[J].J Clin Invest，2002，109（7）：849-855.

Myocardial Expression of Spry1 and MAPK Proteins of Viral Myocarditis

XU Hong-fei1,2,MENG Lin3,YAO Jian3,GU Zhen-yong4,LIU Guo-qing4,SHEN Yi-wen5,ZHAO Zi-qin5
（1．Department of Forensic Medicine,School of Biology and Basic Medical Sciences,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Nantong Tongda Chemicals Safety Evaluation Center,Nantong 226001,China;3.Criminal Police Branch,Nantong Public Security Bureau,Nantong 226001,China; 4.Department of Forensic Medicine,Medical College of Nantong University,Nantong 226001,China;5.Department of Forensic Medicine,Shanghai Medical College of Fudan University,Shanghai 200032,China）

ObjectiveTo discuss the myocardial expression of Spry1 and MAPK proteins of viral myocarditis（VMC）,to reveal its mechanism of sudden death,and to provide guides for forensic identification of sudden cardiac death.MethodsThirty Balb/c male mice were randomly divided into VMC group and control group,inoculated intraperitoneally with Coxsackievirus B3 and Eagel’s solution,respectively．After the mice were sacrificed,the cardiac tissues of the mice were taken to proceed regular pathological examination.The changes of Spry1 protein,Spry1 mRNA and MAPK protein were detected by immunohistochemistry,Western blotting and real-time PCR.ResultsUnder light microscope,the pathologic changes included myocardial interstitial edema,inflammatory cells infiltration,myocardial necrosis, and focal and patchy necrosis of myocardial fiber in VMC group.The expression of Spry1 protein in VMC group was lower than that in control group（P＜0.05）.There was slightly decreased expression of Spry1 of the mRNA level in VMC group（P＞0.05）.But the MAPK protein expression in VMC group was higher than that in control group（P＜0.05）.ConclusionThe pathway of MAPK/ERK involving Spry1 protein accelerates the expression of collagen,which may contribute to arrhythmia,heart failure and even sudden cardiac death.

forensic pathology;death,sudden,cardiac;vital myocarditis;Spry protein;MAPK protein

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.002

1004-5619（2013）03-0164-04

2012-07-17）

（本文編輯：劉寧國(guó)）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172897）；南通市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011053）

許弘飛（1980—），男，安徽蕪湖人，博士，講師，主要從事心源性猝死的法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：whhongfei@sina.com

趙子琴，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：zqzhao@shmu.edu.cn