盧玉飛,蔣建雄,易自力

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

禾本科(Gramineae)芒屬(Miscanthus)是一類C4高大禾草植物。因其生物產(chǎn)量高、碳中和、遺傳適應(yīng)性強(qiáng)以及適應(yīng)邊際土地(Marginal Land)種植，適宜作為新一代非糧能源植物開發(fā)利用[1-5]，因而成為當(dāng)前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。芒屬植物中的核型分析是一項(xiàng)常規(guī)性的重要實(shí)驗(yàn)工作，在芒屬植物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)演化、品種鑒定和多倍體篩選等研究中具有重要意義。本研究在已有核型分析經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參考一些教程[6-8]對圖像處理軟件Adobe Photoshop(CS2版)用法的介紹，系統(tǒng)地摸索在中國芒屬植物的芒(Miscanthussinensis)、五節(jié)芒(M.floridulus)和荻(M.sacchariflorus)等類群的核型分析試驗(yàn)中應(yīng)用該軟件處理染色體圖像的方法，以期為芒、五節(jié)芒、荻和南荻(M.lutarioriparius)等中國芒屬種質(zhì)資源大規(guī)模染色體倍性檢測研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 本研究在摸索過程中采用的染色體圖像來自芒、五節(jié)芒和荻等類群的材料，野外采集其地下根狀莖種植保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬種質(zhì)資源圃內(nèi)；本研究中的圖例所采用的染色體圖像來自一份芒，其原產(chǎn)地為廣東珠海，編號(hào)為C0536。

1.2方法 在資源圃內(nèi)取其幼嫩根尖，按常規(guī)的酶解離后壓片的方法制備染色體玻片標(biāo)本后進(jìn)行鏡檢，選取染色體完整、清晰且分散良好的中期分裂相用Motic Images Advanced 3.2圖像采集系統(tǒng)拍照，存為.bmp格式，之后采用Adobe Photoshop(CS2版)圖像處理軟件對獲得的染色體圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1染色體圖像處理

2.1.1曝光度調(diào)整 如果曝光不足，圖像灰蒙蒙，偏暗。調(diào)整方法如下：1)執(zhí)行“圖像/調(diào)整/色階”和“圖像/調(diào)整/亮度/對比度”或執(zhí)行“圖像/調(diào)整/曲線”，根據(jù)實(shí)時(shí)處理效果設(shè)置相關(guān)參數(shù)。2)或者執(zhí)行“圖像/調(diào)整/曝光度”，增加“曝光度”、減少“位移”和“灰度系數(shù)”。3)或者執(zhí)行“圖像/調(diào)整”的“陰影/高光”項(xiàng)，調(diào)節(jié)“陰影”、“高光”、“調(diào)整”的數(shù)值，使之達(dá)到滿意效果。

如果曝光過度，圖像偏亮，應(yīng)著重調(diào)整高光。處理方法如下：1)參照“曝光不足”的糾正做法，反向調(diào)整。2)或者復(fù)制背景圖層，執(zhí)行“圖像/調(diào)整/變化”，選擇“暗調(diào)”選項(xiàng)，在較暗區(qū)域里單擊(必要時(shí)可多單擊幾次)，接著選擇“高光”后在較暗區(qū)域里單擊，確認(rèn)，該過程中視效果可適當(dāng)降低“精細(xì)度”。3)或者在方法2)的基礎(chǔ)上，為背景副本添加蒙版，選擇“畫筆”工具，調(diào)節(jié)不飽和度和流量，在染色體上擦除以增加染色體亮度。

2.1.2背景初步凈化處理 剛獲得的鏡檢原圖往往都有背景污點(diǎn)，為了不影響觀察和后續(xù)操作，有必要作初步的背景凈化處理，擦除這些背景污點(diǎn)。做法：1)將“縮放”工具與“修補(bǔ)”工具配合使用。放大瑕疵處后，選擇“修補(bǔ)”工具，創(chuàng)建污點(diǎn)選區(qū)，單擊左鍵拖動(dòng)選區(qū)向干凈無瑕疵處移動(dòng)污點(diǎn)，釋放左鍵后取消選區(qū)即可。不過“修補(bǔ)”工具更適合去除較大面積的污點(diǎn)。小細(xì)節(jié)的瑕疵可在放大后，運(yùn)用“修補(bǔ)畫筆”工具，按住[Alt]鍵的同時(shí)到干凈處單擊取樣，松左鍵移到瑕疵處單擊，可覆蓋瑕疵。2)或者選擇“畫筆”工具，按住[Alt]鍵，到干凈處取樣，后單擊左鍵涂抹污點(diǎn)即可。如使用蒙版，不必取樣，可直接用畫筆擦除污點(diǎn)。3)或者使用“仿制圖章”工具，在干凈處按住[Alt]鍵的同時(shí)單擊左鍵取樣，后涂抹污點(diǎn)即可。4)或者使用“多邊形套索”工具，在干凈的背景創(chuàng)建選區(qū)，羽化，按住[Ctrl]鍵單擊左鍵拖動(dòng)選區(qū)覆蓋污點(diǎn)。

2.1.3染色體區(qū)域轉(zhuǎn)移 做法：1)將包含全部染色體的整個(gè)區(qū)域復(fù)制到另一新的文件中。背景為白色，分辨率至少300象素/英寸(下同)。粘貼后根據(jù)具體要求適當(dāng)放大染色體圖像。執(zhí)行“編輯/自由變化”，在單擊左鍵縮放變形框的同時(shí)，加按[Shift]鍵，讓長寬等比例縮放，確認(rèn)。2)或者新建圖像副本圖層，用“裁剪”工具在該圖層里拖拽出需要保留的染色體區(qū)域，按[Enter]鍵即可裁去其它部分。但該方法有局限性，若無復(fù)制圖層的習(xí)慣，使用裁剪工具往往容易裁剪掉后續(xù)操作中還可能用到的背景，最大的問題還是裁剪之后得到的染色體區(qū)域的圖像無法縮放。

2.1.4圖像的色彩與色調(diào)調(diào)整 前面的處理無法突出染色體，且染色體在放大后反而會(huì)略顯模糊。為便于在后續(xù)環(huán)節(jié)中能完整提取染色體，有必要對染色體進(jìn)行色彩與色調(diào)調(diào)整。色彩主要包括亮度、色相、飽和度和對比度；色調(diào)調(diào)整主要是對明暗度調(diào)整。調(diào)整時(shí)，要對比原圖和未做調(diào)整前的圖，確保調(diào)整準(zhǔn)確。而且，不應(yīng)先選擇染色體再調(diào)整，因?yàn)橐坏┰谠紙D片里染色體不夠清晰，那選擇起來就難免有偏差。

方法：1)執(zhí)行“圖像/調(diào)整/曲線”功能，拉動(dòng)節(jié)點(diǎn)改變線條的形狀即可同時(shí)調(diào)整整個(gè)畫面的亮度、對比度及色調(diào)。必要時(shí)(如圖像偏綠)選擇相應(yīng)的顏色通道(如綠色)，調(diào)整曲線狀態(tài)，直到預(yù)覽的圖像色調(diào)滿意為止。然后還可通過“亮度/對比度”、“色相/飽和度”、“色彩平衡”及“可選顏色”等命令進(jìn)一步調(diào)整。2)或者執(zhí)行“圖像/調(diào)整/色階”，通過調(diào)整明暗度來改變圖像的明暗和反差效果。3)或者執(zhí)行“圖像/調(diào)整”的“色相/飽和度”功能，選擇“編輯”列表中除“全圖”之外的任一種顏色，使用“添加到取樣”吸管到染色體身上單擊取色，提高飽和度(色相與亮度增加與否視預(yù)覽效果而定)，同時(shí)配合移動(dòng)對話框下方顏色條的滑塊，把色彩與色調(diào)調(diào)至最佳。4)或者執(zhí)行“圖像/調(diào)整/替換顏色 ”，用“添加到取樣”吸管工具到染色體上單擊取色，在“替換”欄里移動(dòng)“色散”、“飽和度”及“明度”的滑塊，由預(yù)覽效果來決定被替換的顏色。

比如，在上述幾個(gè)類群的芒屬植物染色體玻片標(biāo)本制備實(shí)踐中，因?yàn)槿玖系脑?，拍出的染色體圖像其背景常偏青(綠)，可嘗試以下做法來減輕這種偏色現(xiàn)象：1)執(zhí)行“圖像/調(diào)整/色階”，提高輸入色階的數(shù)值把圖像變暗，接著提高中間色調(diào)數(shù)值使圖像變亮，降低圖像亮部色調(diào)使圖像白色減少，再新建圖層副本，將該副本圖層模式改為“強(qiáng)光”、不透明度設(shè)定為“50%”，執(zhí)行“色彩平衡”，減少青色和綠色的比例。2)或者執(zhí)行“曲線”命令，選擇“綠色”通道，根據(jù)預(yù)覽結(jié)果精細(xì)調(diào)整綠色輸入和輸出值；之后選擇“RGB”通道，進(jìn)一步從總體上調(diào)整，最后執(zhí)行“色相/飽和度”，減少“綠色”飽和度并稍稍減少其色散。

2.1.5背景去除 為了對染色體做進(jìn)一步的精確分析，有必要將染色體整體提取出來(相當(dāng)于去除背景)，以免后續(xù)分析時(shí)受背景干擾?？傮w思路是首先選擇全部染色體而非單個(gè)選擇，以確保所有染色體之間的相對位置保持不變。而且，這個(gè)過程中當(dāng)放大染色體時(shí)就要確定染色體的合適大小并確保它們均按同一比例縮放，為后續(xù)進(jìn)行同源染色體配對準(zhǔn)備。

方法1)：選擇“魔棒”工具，設(shè)定“容差”值(需反復(fù)比較哪個(gè)容差值更趨向于能正好選擇完染色體，筆者常采用約50的值)，讓“連續(xù)”選項(xiàng)處于非選擇狀態(tài)，在染色體上創(chuàng)建染色體選區(qū)，放大圖像，選擇“多邊形套索”工具，按[Shift]鍵的同時(shí)框選遺漏的區(qū)域(淺染區(qū)常常被漏選)或按[Alt]鍵減選多余背景，將完整的染色體選區(qū)粘貼到另一新建文件，放大圖像，對照原圖，并根據(jù)此前已明確的染色體數(shù)目和交叉重疊區(qū)域，主要應(yīng)用“多邊形套索”工具和“橡皮擦”工具進(jìn)一步修正，包括刪減多余背景、復(fù)原此前漏選的著色淺的染色體部位，確保還原染色體在原始圖片里呈現(xiàn)的真實(shí)特征，得到邊緣清晰且背景干凈的染色體圖譜。

方法2)：執(zhí)行“選擇/色彩范圍”， 在“色彩范圍”對話框選擇“圖像”來顯示染色體圖像，同時(shí)設(shè)定一個(gè)合適的“容差”值(比如50左右)，綜合運(yùn)用所提供的吸管工具在染色體上單擊選擇，創(chuàng)建了盡可能完整的染色體選區(qū)，后面步驟同方法1)。如果背景均勻、色彩單一時(shí)，執(zhí)行該命令單擊背景取樣，然后按[Delete]鍵刪除背景留下染色體，重復(fù)多次可把背景盡可能刪除，最好再執(zhí)行上述方法1)就可以更完整清晰地選取染色體。

方法3)：執(zhí)行“通道摳圖”。打開染色體圖像，轉(zhuǎn)到通道面板，復(fù)制與背景色相近的那個(gè)通道得到副本，調(diào)整“色階”參數(shù)(以便最后能完整選擇染色體)，按 [Ctrl]鍵，同時(shí)單擊剛才復(fù)制的通道副本，創(chuàng)建染色體選區(qū)，反選，回到圖層面板，單擊“多邊形套索”工具，按[Shift]鍵時(shí)繼續(xù)選擇，以增加此前被遺漏的染色體選區(qū)(反之，按[Alt]鍵)。

說明：1)不建議使用“背景橡皮擦工具”或“魔術(shù)橡皮擦”工具來擦除背景。使用前者擦除后會(huì)遺留一些細(xì)微污點(diǎn)，而后者會(huì)自動(dòng)擦除顏色相近區(qū)域，極易擦掉染色體的部分邊緣。2)可嘗試通過加大景深的方法來突出染色體，有助于對其選擇。即：①用“修補(bǔ)”工具擦除背景污點(diǎn)，新建該圖像的副本圖層，對這個(gè)副本圖層執(zhí)行“濾鏡/模糊”(由預(yù)覽效果決定選何種模糊方式，筆者常用高斯模糊)，給這個(gè)副本圖層增加一個(gè)圖層蒙版，確定前景色為黑色，背景色為白色，用畫筆仔細(xì)涂抹即可擦除染色體的蒙版，染色體將變得清晰并加大與背景的反差?；颌谶x擇染色體后，反選，先后執(zhí)行“選擇/修改/擴(kuò)展(筆者常用2象素)”和“選擇/修改/平滑(取樣半徑3象素)”，再先后執(zhí)行高斯模糊、背景模糊。3)不主張使用“濾鏡”的“抽出”命令來抽出染色體而達(dá)到去除背景的目的。盡管它比橡皮擦工具更加智能化，但是執(zhí)行該命令需要逐個(gè)勾畫出染色體，一是工作量的問題，最要緊的是如果不夠熟練，勾畫染色體時(shí)將極易產(chǎn)生偏差。4)同樣不主張使用“鋼筆”工具來創(chuàng)建染色體選區(qū)。因?yàn)槔L制每個(gè)染色體選區(qū)，不僅工作量讓人難以堅(jiān)持，而且繪制染色體邊緣時(shí)一是易出錯(cuò)，二是整個(gè)路徑不平滑不自然。同樣，不主張使用“套索”工具。

2.1.6交叉染色體分離 本文所言的染色體交叉包含染色體交錯(cuò)或部分重疊兩種情況，尚未在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)兩條染色體完全重疊的情況。為了實(shí)現(xiàn)后續(xù)的染色體長度測量及同源染色體配對，需要將發(fā)生交叉的染色體分離。

操作方法如下(這里不考慮進(jìn)行帶型分析的情況)：放大發(fā)生交叉的兩條染色體，用“多邊形套索”工具繪制出交叉染色體中的任一條，轉(zhuǎn)化成選區(qū)，使用“移動(dòng)”工具將選區(qū)復(fù)制到原交叉區(qū)域附近空白處，使用“多邊形套索”工具，在原處選擇這條染色體除交叉區(qū)域之外的剩余部分并刪除，這時(shí)在原處就只剩下另一條染色體了，這相當(dāng)于交叉的兩條染色體實(shí)現(xiàn)了分離。如果是兩條以上的染色體發(fā)生交叉，實(shí)現(xiàn)分離的操作方法類似。必要時(shí)對分離后染色體的不平滑邊緣再做修整(圖1)。

說明：不應(yīng)先移動(dòng)任一條染色體的非交叉區(qū)域，再復(fù)制交叉區(qū)域來填補(bǔ)。因?yàn)檫@種“先移后補(bǔ)”的做法會(huì)很容易使得被填補(bǔ)的公共區(qū)域無法與原染色體自然融為一體。而前面“先復(fù)制后刪除”的做法卻能保持整條染色體的完整性。

2.2同源染色體配對 染色體圖像經(jīng)過上述處理后，此時(shí)可直接選一個(gè)鏡檢原圖最清晰、染色體分散程度高且圖像處理效果也最佳的分裂相，根據(jù)事先已明確的這個(gè)分裂相里同源染色體的配對情況，從中選擇染色體來完成配對。做法：復(fù)制一份已分開交叉染色體且已編號(hào)的圖譜為操作對象，對照原圖運(yùn)用“魔棒”工具逐條選擇染色體并剪切粘貼到新建文件中，保持大小不變，短臂統(tǒng)一朝上。最后，保存文件，以便單獨(dú)使用配對圖時(shí)方便取用。而且，要在這個(gè)配對圖旁邊加上該分裂相的鏡檢原圖以及剛?cè)コ尘昂蟮膱D像和分離了交叉染色體后的圖像，以便比較(圖1)。

2.3核型模式圖繪制 基于染色體核型參數(shù)中的相關(guān)測量值，在Excel中按照已有方法[9]生成柱狀圖，隨后將此圖粘貼到新建的Photoshop文件中編輯，使用該軟件里的“鋼筆”工具及其他相關(guān)工具在該文件窗口的縱向參考線以及橫向網(wǎng)格線的定位下在柱狀圖上繪制表示著絲點(diǎn)位置的對稱缺刻。

圖1 編號(hào)為C0536的芒(M.sinensis)的核型圖譜Fig.1 Karyotype of an accession (No.C0536)of M.sinensis

3 討論與結(jié)論

核型分析是早已發(fā)展起來的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但傳統(tǒng)的方法步驟比較繁多[10]，在實(shí)際操作中不僅耗時(shí)費(fèi)力，也往往容易出現(xiàn)人為誤差[10-11]?，F(xiàn)在隨著通過采用顯微數(shù)碼攝影技術(shù)來獲取染色體圖像的相關(guān)儀器軟件的普及應(yīng)用，客觀上也要求運(yùn)用相關(guān)軟件對染色體圖像進(jìn)行后期處理。

Adobe Photoshop是圖像處理功能強(qiáng)大的常用軟件。雖然有不少資料和網(wǎng)站介紹這個(gè)軟件的用法，其思路和方法可以供染色體圖像處理時(shí)借鑒參考，但染色體圖像處理有其特殊性，顯然不同于一般照片處理，在具備專業(yè)背景的前提下要求更為細(xì)致，尤其對染色體數(shù)目較多(2n=38)且微小的上述類群的芒屬植物而言，對其染色體圖像的處理更需如此。近年已有一些報(bào)道介紹在進(jìn)行核型分析時(shí)應(yīng)用Photoshop軟件處理染色體圖像[10,12-15]，效率較高，這表明了在核型分析等相關(guān)工作中應(yīng)用該軟件處理染色體圖像的可操作性。不過，這些報(bào)道所述方法往往側(cè)重于核型分析過程中有關(guān)染色體圖像處理的某一或某些環(huán)節(jié)，而在系統(tǒng)性與適用性方面似有不足。

本研究試圖系統(tǒng)地探討利用Photoshop軟件處理上述幾個(gè)類群的芒屬植物染色體圖像的處理方法。因此，本文在注重對整個(gè)分析思路進(jìn)行闡述的同時(shí)，注重在具體操作方法上予以描述，力圖做到周到、詳盡。對不少環(huán)節(jié)還提供了多種方法以便讀者參考、比較，并說明了一些注意點(diǎn)，旨在幫助讀者形成更完整、清晰的染色體圖像處理思路。在芒、五節(jié)芒和荻等類群的核型分析中的應(yīng)用實(shí)踐也表明本文所述方法的可操作性和適用性較強(qiáng)，使用效果較佳。所以，筆者希望本研究對其他類群植物的染色體圖像處理也有參考價(jià)值。礙于篇幅限制，一些操作細(xì)節(jié)未能闡述。此外，一些做法，比如利用此軟件的測量功能對染色體進(jìn)行測量的做法本文也略去，因?yàn)橐延形墨I(xiàn)[12-15]闡述?？傊P者希望本文能為相關(guān)研究提供多一種解決問題的參考思路。

[1] 劉亮,朱明,朱太平.芒荻類植物資源的開發(fā)和利用[J].自然資源學(xué)報(bào),2001,16(6):562-563.

[2] Heaton E A,Clifton-Brown J,Voigt T B,etal.Miscanthus for renewable energy generation:european union experience and projections for Illinois[J].Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change,2004,9(4):433-451.

[3] Clifton-Brown J,Chiang Y C,Hodkinson T R.Miscanthus:Genetic resources and breeding potential to enhance bioenergy production[A].In:Vermerris W.Genetic Improvement of Bioenergy Crops[M].New York:Springer Science+Business Media,LLC,2008:273-294.

[4] Jakob K,Zhou F S,Paterson A H.Genetic improvement of C4grasses as cellulosic biofuel feedstocks[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant,2009,45(3):291-305.

[5] Sang T,Zhu W X.China’s bioenergy potential[J].GCB Bioenergy,2011,3(2):79-90.

[6] 籍寧,楊彥嶺.Photoshop CS2中文版完全自學(xué)手冊[M].北京:電子工業(yè)出版社,2007:1-606.

[7] 清風(fēng)書坊.中文版Photoshop CS2家庭數(shù)碼照片暗房72技[M].北京:兵器工業(yè)出版社,2007:1-281.

[8] 麥偉彬,平燕波.光影傳奇——中文Photoshop數(shù)碼照片處理典型實(shí)例[M].北京:機(jī)械工業(yè)出版社,北京科海電子出版社，2007：1-342.

[9] 喬永剛,宋蕓.利用EXCLE制作核型模式圖[J].農(nóng)業(yè)網(wǎng)絡(luò)信息,2006(10):97-98.

[10] 蔣姍姍,梁英民,王作軍.利用個(gè)人電腦系統(tǒng)及photoshop軟件進(jìn)行核型分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(7):860.

[11] 劉麗琴,胡玉林,石勝友,等.基于MATLAB圖像處理的染色體核型分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(1):185-187.

[12] 周友泉,王厚照.PHOTOSHOP在染色體參數(shù)測量中的應(yīng)用[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2003,21(1):43，24.

[13] 楊大翔.用Adobe Photoshop進(jìn)行核型分析[J].農(nóng)業(yè)網(wǎng)絡(luò)信息,2005(3):45-46，44.

[14] 周勁松,蘇小波,湯泳萍,等.利用Photoshop進(jìn)行蘆筍核型分析的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(2):73-75.

[15] 周洲,顧曙余.核型分析實(shí)驗(yàn)中的圖像處理[J].生物學(xué)雜志,2010,27(6):95-96，99.