丁 洋 魏 敏 孟祥河

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310014)

磷脂是一種重要膳食成分，廣泛存在于大豆、菜籽、葵花籽等油料作物中，在大豆油中，磷脂的質(zhì)量分數(shù)約為0.1%～1.8%，脫膠以后磷脂的含量約為20 mg/kg[1]。目前，磷脂含量的檢測方法主要有鉬藍比色法[2]，重量法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色譜法[5－6]，薄層色譜法[7－8]和31P核磁共振光譜法[9－10]等，其中常用的檢測方法如高效液相色譜法可對磷脂單體進行準確定量，但成本昂貴，而且復雜的樣品富集前處理同樣不可或缺。總磷脂的測定常采用鉬藍比色法，問題是需要耗費大量的時間，并且非磷脂磷會帶來較大的誤差。

近些年來，隨著化學計量學的研究應(yīng)用，傅里葉變換紅外光譜儀在物質(zhì)成分的定量分析中逐步得到了廣泛的應(yīng)用。Christoph Krafft等[11]利用近紅外、拉曼光譜分析了人腦的磷脂組成及各基團的特征吸收峰，但是沒有進行定量研究。Nzai等[12]利用中紅外光譜法測定了大豆毛油中磷脂的含量，采用朗伯－比爾定律的方法建立標準曲線，發(fā)現(xiàn)相對于傳統(tǒng)的磷分析技術(shù)具有快速、簡單、穩(wěn)定的優(yōu)點，但其背景如何扣除不清楚，方法的準確性和精確性均不高。Kuligowski等[13]利用凝膠色譜法結(jié)合衰減全反射紅外光譜(FTIR－ATR)研究了大豆油中卵磷脂的含量，但是ATR靈敏度低，不適用于低濃度磷脂的檢測，并且檢測之前需要凝膠色譜預分離，不能直接對油中的磷脂進行檢測，Aleksandra Szydlowska－Czerniak[14]利用中紅外光譜結(jié)合偏最小二乘法對生產(chǎn)過程中各階段菜籽油中磷脂的含量進行了檢測，研究發(fā)現(xiàn)，中紅外光譜在860～1 760 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)能夠很好的確定磷脂的含量，但其方法需要以相應(yīng)的脫磷脂油作對照，因此使得FTIR/PLS方法樣品處理復雜化。

本研究以大豆油，葵花油和菜籽油為代表進行綜合分析，運用偏最小二乘法建立定量分析模型，樣品只需正己烷溶解即可，省去了脫膠油作為對照的必要性，方法簡便、快速，效果良好。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷:色譜純Sigma－Aldrich公司；大豆磷脂:廣州市海圣生物科技有限公司，通過鉬藍比色法測定其磷脂的含量為911.59 mg/g；精煉大豆油、葵花油、菜籽油:一級精煉油，市售；其他試劑均為分析純。

Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀:德國Bruker公司；可見分光光度計:日本島津公司；微波爐:格蘭仕公司；馬弗爐:上海意豐電爐廠。

1.2 樣品的制備

大豆油、葵花油和菜籽油經(jīng)硅膠柱過濾，去除其殘余的微量磷脂。精確稱取大豆磷脂(精確到0.01g)分別溶解在經(jīng)硅膠柱過濾的3種油中，用微波爐加熱60 s，振蕩混勻，制成 200～20 000 mg/kg的磷脂－大豆油/葵花油/菜籽油混合液，精確稱取上述混合液1.00 g，用正己烷稀釋至5.00 g。

1.3 方法

1.3.1 鉬藍比色法測量磷脂的含量

鉬藍比色法采用 GB5537—2008[15]中的方法，植物油中的磷脂經(jīng)灰化后變?yōu)槲逖趸?，后被鹽酸變?yōu)榱姿?，遇鉬酸鈉生成磷鉬酸鈉，然后被硫酸聯(lián)氨還原成鉬藍，用分光光度計在波長650 nm處測定鉬藍的吸光度，與標準曲線比較計算磷脂的含量。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜參數(shù)設(shè)定及樣品光譜采集

Bruker Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀，檢測器為RT－DLaTGS，采用100μm CaF2液體樣品池。樣品的光譜采集范圍是400～4 000 cm－1，光譜分辨率是2 cm－1，以空氣作背景，背景和待測樣品均掃描16次。

樣品光譜采集選用透射的方式，室內(nèi)溫度控制在25℃，濕度保持恒定，每次測量樣品紅外光譜前，樣品池用正己烷清洗4次，然后用待測樣品潤洗3次，每個樣品測量2次，取其平均值作為測量的結(jié)果。共得到紅外光譜212個，其中大豆油116個，葵花油41個，菜籽油55個。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂紅外譜圖的分析

從圖1可以看出，其紅外光譜圖在800～1 300 cm－1，1 300～1 520 cm－1，1 700～1 780 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)具有明顯的吸收峰，在2 600～3 100 cm－1范圍內(nèi)具有較寬的吸收峰，其中2 600～3 100 cm－1，1 410～1 570 cm－1為磷脂和三酰甘油中C—H基團的反對稱和對稱伸縮峰，1748 cm－1處為C＝O的伸縮峰，與磷相關(guān)的基團的吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1(圖1a，圖1b)，其中1 246 cm－1為 PO2的不對稱伸縮峰，1 035 cm－1為P—O—C的對稱伸縮峰，1 162 cm－1為 C＝O—O—C中 C—O的伸縮峰，1 066 cm－1處為C—O—PO2中C—O—P的不對稱伸縮峰。然而，CH3，CH2，C＝O和 C—O—C在植物油和磷脂中共同存在，但是由于磷脂中一個磷酸基團替代了普通甘油酯中的一個C—O—C和C＝O基團，C—O—C和C＝O的峰高會隨著磷脂含量的增加而減少。P＝O，PO2，P—O—C為磷脂中特有的特征吸收峰，它們的峰高會隨著磷脂含量的增加而增加。在建立磷脂的定量分析模型中，選用800～1 300 cm－1波數(shù)范圍的吸收峰。

圖1 磷脂的傅里葉變換紅外光譜圖

2.2 異常樣品的去除

由于人工操作或者儀器環(huán)境等原因，通常會產(chǎn)生一些異常樣品，在紅外光譜的測量中通常會存在兩類異常樣品，一類是樣品化學值比較極端，影響模型預測的準確性，但一般能提高模型的適應(yīng)能力，這類異常樣品可以用馬氏距離(杠桿值)來剔除。另一類就是測量樣品的參考測量值有誤，其誤差范圍超出了標準的規(guī)定范圍，該樣品不能用于模型的建立，這類異常樣品可用學生殘差予以剔除。如果樣品的化學值確實準確無誤或者該樣品對模型的準確度影響不大，那么馬氏距離判定的異常樣品在一般情況下不予剔除，這樣可以保證模型的廣泛適用性，學生殘差判定的異常樣品一般需要剔除。

圖2 磷脂樣品紅外光譜的馬氏距離排序圖及學生殘差分布圖

本試驗異常樣品的去除是通過馬氏距離結(jié)合學生殘差進行的，圖2為其馬氏距離排序圖和學生殘差值分布圖。從圖2中可以看出，782.03 mg/kg和899.33 mg/kg這兩個質(zhì)量濃度的樣品的馬氏距離高于其他樣品，同時這兩個樣品的學生殘差較大，因此認定這兩個樣品為異常樣品，在建模的過程中予以去除，其他樣品馬氏距離較小，學生殘差分布集中，因此作為有效樣品應(yīng)用于建模分析。

2.3 模型的建立與優(yōu)化

2.3.1 建模樣品的選擇

在待測樣品中隨機挑選141個樣品作校正集，最小質(zhì)量濃度213.28 mg/kg，最大質(zhì)量濃度19 967.73 mg/kg，平均質(zhì)量濃度是 7 038.79 mg/kg。其余的 69個樣品作為驗證集，最小質(zhì)量濃度445.97 mg/kg，最大質(zhì)量濃度 18 642.50 mg/kg，平均質(zhì)量濃度是7 449.30 mg/kg。

2.3.2 光譜預處理對建立模型的影響

采用TQ Analyst紅外定量分析軟件對測得的紅外光譜進行預處理及分析，通過適當?shù)念A處理，可以減弱以至消除各種非目標因素對光譜的影響，凈化譜圖信息，為校正模型的建立、未知樣品組成或性質(zhì)預測奠定一定的基礎(chǔ)。預處理過程包括SNV、一階導數(shù)、二階導數(shù)、卷積平滑等[16]，通過分析不同預處理方法對模型各性能的影響確定合適的預處理方法。表1為偏最小二乘回歸結(jié)合不同的預處理方法建立紅外定量分析模型的分析結(jié)果。

表1 基于偏最小二乘結(jié)合不同的預處理方法建立磷脂含量模型的分析

從表1中可以看出采用原始光譜、SNV、9階平滑處理的效果好于其他樣品預處理的方法，其主成分數(shù)都為10，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.995 2、0.996 8和0.996 1。在后續(xù)的分析過程中將對原始光譜，SNV和9階平滑處理得到的光譜進行比較。

2.3.3 波數(shù)范圍及主成分數(shù)對建立模型的影響

偏最小二乘法是一個全光譜的方法，然而在有些情況下，光譜噪聲或者樣品中出現(xiàn)的附加組分會造成PLS算法解析這些特征，從而使模型的穩(wěn)定性降低。這時就需要選擇PLS回歸的頻率范圍，并使譜圖包含所有的特征官能團，磷脂的特征吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)，因此在選擇建模的波數(shù)范圍時，這個波數(shù)范圍將重點考慮。表2列出了不同波數(shù)范圍對建立模型的分析結(jié)果。

表2 基于偏最小二乘回歸結(jié)合不同波數(shù)范圍所建磷脂含量模型的分析結(jié)果

從表2的數(shù)據(jù)中可以看出，970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)所建的模型性能最好，主成分因子數(shù)較低，相關(guān)系數(shù)均達到0.99以上，RMSEC和RMSEP均較小。在這個波數(shù)范圍內(nèi)主要是磷脂中與P—O—C，PO2，P＝O等與磷有關(guān)的基團的特征吸收峰，受其他成分的干擾較少，并且根據(jù)朗伯－比爾定律，其吸光度隨磷脂含量的增加而增加，有很好的線性關(guān)系，因此所建模型最好。除與磷有關(guān)的特征峰以外，磷脂中的另一個特征基團就是1 710～1 780 cm－1范圍內(nèi)的羰基的吸收振動峰，經(jīng)分析，由于磷脂中含有的羰基少于油脂中的羰基，所以羰基的吸收峰隨著磷脂含量的增加而減少，但是采用這個波數(shù)范圍建立的模型效果并不好，原因可能是油中的羰基含量太高而磷脂的含量對它的影響很小，或者可能是這個波數(shù)范圍太窄，不能包含磷脂紅外光譜的所有信息。同樣，970～1 320 cm－1結(jié)合1 710～1 780 cm－1同樣受到C＝O的影響，導致結(jié)果不理想，另外采用全波數(shù)建模相關(guān)系數(shù)較差，并且RMSEC和RMSEP均較大，原因可能是建模過程中無用的信息太多，影響了建模效果。

另外，采用PLS法建立定量分析模型時，主成分數(shù)的選擇將直接影響到模型的預測能力。使用的主成分數(shù)過多，會引入一些噪音，使用的主成分數(shù)過少，則不能充分反映樣品的光譜信息，這都將降低模型的預測能力，本次分析通過留一交互驗證法，當交互驗證均方差(RMSECV)和預測殘差平方和(PRESS)均較小時，所選主成分數(shù)最好。通過分析在970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)，SNV，9階平滑處理的光譜和原始光譜的主成分數(shù)分別為4、5、5。

結(jié)合光譜的預處理可以得到，經(jīng)SNV處理的紅外光譜，在970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)建立的模型為最優(yōu)化模型。其主成分數(shù)為4，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 9，RMSEC和 RMSEV分別為316、386。

2.4 模型的驗證

2.4.1 FTIR/PLS模型準確值和預測值之間的相關(guān)關(guān)系

圖3給出了200～20 000 mg/kg范圍的最優(yōu)模型的準確值和預測值之間的相關(guān)關(guān)系，從圖中可以看出，樣品的準確值和預測值之間的線性回歸系數(shù)達到0.997 9，預測值和準確值之間的關(guān)系吻合良好，表明此模型能夠很好的預測樣品中磷脂的含量。

圖3 FTIR/PLS模型準確值和預測值之間的相關(guān)關(guān)系圖

2.4.2 FTIR/PLS法同鉬藍比色法測量結(jié)果的比較

為了驗證FTIR方法的有效性，選擇精煉菜籽油，精煉葵花油，大豆毛油，菜籽毛油和經(jīng)過稀釋的磷脂濃縮物5個樣品，用FTIR/PLS法和鉬藍比色法分別測其磷脂的含量，各測5次，結(jié)果見表3所示。

表3 FTIR/PLS法同鉬藍比色法測量結(jié)果的分析

如表3所示，鉬藍比色法的相對標準偏差為1.48%～3.87%，平均相對標準偏差為2.47%，而FTIR測得的磷脂含量的相對標準偏差為1.42%～3.52%，平均相對偏差為2.36%。兩者的平均相對誤差為0.75%，表明FTIR法能夠代替鉬藍比色法實現(xiàn)植物油中磷脂的快速檢測。

3 結(jié)論

本研究采用了添加大豆磷脂的方式制備樣品，制備的樣品中包含大豆油、葵花籽油、菜籽油，采用偏最小二乘法建立定量分析模型，選用的化學計量學方法可解析譜圖中的特征吸收峰，提取有用信息，降低不同品種油中磷脂組成不同對結(jié)果的影響。由結(jié)果可知，精確度和準確度相對較高，線性關(guān)系和適用性良好，與HPLC，鉬藍比色法等相比簡單快速，不需要復雜的樣品處理過程，該方法適合不同磷脂含量(200～20 000 mg/kg)油脂樣品的快速檢測。

參考文獻

[1]Przybylski R，Eskin.Phospholipid composition of canola oils during the early stages of processing as measured by TLCwith flame－ionization detector[J].The Journal of the American Oil Chemists＇Society，1991，68(4):241－245

[2]辛鳳鮮.快速測定油脂中的磷脂[J].中國油脂，2003，28(1):61－62

[3]陳曉翔，蘇彩珠，陳奕.同時測定大豆磷脂中總磷脂及油含量[J].中國油脂，2008，33(11):73－75

[4]Siqueira－Moura M P，Lira M C B，Santos－Magalhaes N S.Validation of a UV－spectrophotometric analytical method for the determination of usnic acid in liposomes[J].Revista Brasileira de Ciencias Farmaceuticas.2008，44(4):621－628

[5]夏海濤，安紅，劉郁芬，等.大豆磷脂的高效液相色譜分析[J].分析化學，2001，29(09):1046－1048

[6]Wang Y H，Ira SK，Carrie L.Complexation with iron at subppm levels in HPLCanalyses of phospholipids[J].Biomedical Chromatography，2003，17(2－3):149－157

[7]馬辰，段宏瑾.大豆磷脂中磷脂類成分的含量測定[J].中國中藥雜志，1999，24(11):671－672

[8]Dynska－Kukulska K，Ciesielski W.Methods of extraction and thin－layer chromatography determination of phospholipids in biological samples[J].Reviews in Analytical Chemistry，2012，31(1):43－56

[9]汪勇，王興國，胡學煙.磷脂含量及組成的分析檢測方法[J].中國油脂，2002，27(4):64－67

[10]Yao L X，Jung S.P－31 NMR Phospholipid Profiling of Soybean Emulsion Recovered from Aqueous Extraction[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(8):4866－4872

[11]Christoph K，Lars N，Thomas S.Near infrared Raman spectra of human brain lipids[J].Spectrochimica Acta Part A，2005，61(7):1529－1535

[12]Nzai J M，Proctor A.Phospholipids determination in vegetable oil by thin－layer chromatography and imaging densitometry[J].Food Chemistry，1998，63(4):571－576

[13]Kuligowski J，Quintas G，Esteve－Turrillas F A.On－line gel permeation chromatography－attenuated total reflectance－Fourier transform infrared determination of lectance－Fourier transform infrared determination of lecithin and soybean oil in dietary supplements[J].Journal of Chromatography A，2008(1):71－77

[14]Aleksandra Szyd?owska－Czerniak.MIR spectroscopy and partial least－squares regression for determination of phospholipids in rapeseed oils at various stages of technological process[J].Food Chemistry，2007(105):1179－1187

[15]GB5537－2008，糧油檢驗 磷脂含量的測定[S]

[16]Jia D，Huang Y，Li Z H，et al.Determination of 27 chemical constituents in Chinese southwest tobacco by FT－NIR spectroscopy[J].Industrial Crops and Products，2012，40:21－26.