舒友琴 徐 軍

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院質(zhì)量檢測與管理系，鄭州 450011)

食品中淀粉測定的國標(biāo)方法為酶水解法和酸水解法[1]。酶水解法即在淀粉酶的作用下，使淀粉水解為麥芽糖和低分子糊精，再進(jìn)一步酸水解，使淀粉全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖，然后按測定還原糖的方法測定生成的葡萄糖，再折算成淀粉的含量。方法繁瑣費時，而且淀粉酶不能重復(fù)使用，造成酶試劑的浪費。

酶固定化技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)，可提高酶的催化效率、降低使用成本，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用等一系列優(yōu)點[2－3]。固定化酶所使用的載體有高分子載體、無機(jī)載體、復(fù)合載體以及新型載體等[4－7]。分子篩作為酶的新型載體材料，已廣泛應(yīng)用于各種酶的固定化[8－9]。MCM－41介孔分子篩是一種孔徑介于2.0～50 nm之間的分子篩，由于其具有規(guī)整的介孔孔道、獨特的液晶自組織合成機(jī)理、組分的多樣可變性及極高的比表面積，以及良好的熱穩(wěn)定性，故在固定化酶方面有著特有的優(yōu)勢，但目前的研究多集中于固定化條件及固定化酶的性能研究[10－11]，而鮮見用于分析測定的報道。

本研究以MCM－41介孔分子篩作為載體固定了α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶，制備了固定化的酶柱，并結(jié)合流動注射化學(xué)發(fā)光體系，建立了快速測定食品中淀粉含量的新方法，并對8種不同的樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品:市售，包括2個含脂肪較多的樣品即火腿腸和餅干；5個含脂肪較少的樣品即饅頭、雞蛋掛面、小麥粉、玉米面和豆?jié){；1個淀粉類樣品即涼皮。

α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶(生物試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；可溶性淀粉標(biāo)準(zhǔn)品(分析純):北京紅星化工廠；魯米諾(Luminol，3－氨基鄰苯二甲酰肼，又名發(fā)光氨)(分析純)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(分析純):北京化學(xué)試劑廠；正硅酸乙酯(TEOS)(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；K3[Fe(CN)6]及其他有關(guān)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

IFIS－C型智能流動注射進(jìn)樣器、GD－1型微光測量儀:西安瑞科電子設(shè)備有限公司；R－60型Rikadenki記錄儀:日本株式會社東海理化電機(jī)制作所；HJ－5數(shù)顯恒溫多功能攪拌器:金壇市榮華儀器制造有限公司；HZS－H型水浴振蕩器:哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；DZF－6051真空恒溫干燥箱:深圳市鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司；TU－1810紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 酶柱反應(yīng)及發(fā)光測定原理

反應(yīng)生成的 H2O2與 Luminol在 K3[Fe(CN)6]的催化下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與生成的H2O2的量成正比，即與樣液中淀粉的含量成正比，從而求出樣品中的淀粉含量。發(fā)光分析的流路系統(tǒng)如圖1所示。

圖1 流動注射化學(xué)發(fā)光分析流路圖

1.4 固定化酶柱的制備

1.4.1 MCM－41介孔分子篩的制備

MCM－41的合成參照劉雷等[12]和張波等[13]的文獻(xiàn)進(jìn)行。取蒸餾水150 mL，依次加CTAB 4.4 g，NaOH 0.8 g，攪拌15 min后逐滴加入TEOS15.5 mL，繼續(xù)攪拌2 h。110℃ 晶化24 h，冷卻、過濾、洗滌。50℃干燥過夜后，于馬弗爐中540℃灼燒6 h，所得粉末即為MCM－41介孔分子篩材料。

1.4.2 酶的固定化

稱取α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶各0.20 g，分別溶于的100 mL pH 5.5的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液中，充分?jǐn)嚢韬箪o置2 h以上，所得上清液即為各酶的酶液。

稱取0.2 g MCM－41介孔分子篩載體3份，分別放入3只帶塞的離心管中，各加入上述3種酶的酶液3.0 mL，置于轉(zhuǎn)速150 r/min、20℃ 的恒溫振蕩器中10 h，離心分離，用緩沖溶液洗滌固體，再離心分離、洗滌，如此反復(fù)直至上清液中檢測不到酶活為止。所得固體即為固定化酶，室溫真空干燥后，于4℃下冰箱保存。

1.4.3 酶柱的制備

取一定量的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶的固定化酶固體，分別壓碎混勻后，依次裝入8 mm×120 mm的塑料管內(nèi)(每種約占1/3)，兩端用玻璃棉封住。即制成固定化的酶柱，不用時保存于4℃的冰箱中。固定化時間、給酶量、溶液pH都會對酶的固定化率產(chǎn)生影響[14]。通過多次試驗，本研究采用的固定化條件為固定化時間10 h、每種酶給酶量30 mg/g、溶液pH 5.5。試驗測得3種酶的固定化率分別為66%、68%和72%。

1.5 固定化酶的活性

固定化后的α－淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的活性采用消色法測定[15]，葡萄糖氧化酶的活性采用4－氨基安替吡啉、苯酚和辣根過氧化物酶(HRP)體系測定[16]。

本試驗的α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶的酶活單位分別指在40℃、pH 6條件下，每小時水解1 g淀粉所需的固定化酶量、每小時水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需的固定化酶量和每分鐘產(chǎn)生1μmol葡萄糖酸和H2O2所需的固定化酶量。

淀粉的固定化酶化學(xué)發(fā)光法測定的基礎(chǔ)是3種酶的催化反應(yīng)，溫度、酸度對酶的催化活性均有影響，多次測定的結(jié)果表明，在50～60℃、pH 4.5～5.5的條件下，體系有最大的發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 樣品的預(yù)處理

1.6.1 含脂肪較多的樣品

稱取試樣1～5 g(視樣品含淀粉量而定，通過調(diào)節(jié)稱樣量和定容體積，把樣液濃度調(diào)節(jié)在10～150 mg/L的線性測定范圍內(nèi))，置于鋪有濾紙的漏斗內(nèi)，先用50 mL乙醚分5次洗滌以除去脂肪，再用100 mL85%乙醇分5次洗滌以除去可溶性糖類。用50 mL水將殘渣移至250 mL燒杯中。將燒杯置沸水浴中加熱15 min，以使淀粉糊化溶解，冷卻后移入1 000 mL容量瓶中，調(diào)節(jié)溶液的pH 5.0，定容。用快速濾紙過濾，得濾液備用。

1.6.2 含脂肪較少的樣品

可省去除脂肪的操作，其余步驟同1.6.1。

1.6.3 淀粉類樣品

稱樣后可直接糊化，其余步驟同1.6.1。

1.7 化學(xué)發(fā)光試驗方法

按圖1所示，將各流通管分別插入相應(yīng)的試劑溶液中，打開蠕動泵，待信號穩(wěn)定后，記錄發(fā)光強(qiáng)度。以體系的發(fā)光強(qiáng)度和空白發(fā)光強(qiáng)度之差定量。本測定采用的 Luminol濃度為1×10－3mol/L，K3[Fe(CN)6]濃度為2.5×10－2mol/L，二者流速均為10 r/min。

2 結(jié)果和討論

2.1 影響酶柱工作性能的因素

2.1.1 柱溫的影響

在Luminol溶液的pH 9.0，淀粉溶液的pH 5.0、流速為2 r/min的條件下，按化學(xué)發(fā)光試驗方法分別測定酶柱在 20、30、40、50、60、和 70℃時，由 100 mg/L淀粉標(biāo)液所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2。

圖2 柱溫對發(fā)光強(qiáng)度的影響

由圖2可見，當(dāng)酶柱溫度保持在50～60℃時，體系有最大的發(fā)光強(qiáng)度。選用的酶柱使用溫度為55℃。

2.1.2 淀粉溶液酸度的影響

在Luminol溶液的pH 9.0，淀粉溶液的流速為2 r/min，酶柱溫度保持在55℃的條件下，按化學(xué)發(fā)光試驗方法分別測定由100 mg/L淀粉標(biāo)液在pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和 7.0時所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3。

圖3 pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響

由圖3可見，淀粉溶液的酸度在pH 4.5～5.5時，體系的發(fā)光強(qiáng)度最大。選用淀粉溶液的酸度為pH＝5.0。所以，在處理樣品和配制標(biāo)液時，應(yīng)調(diào)節(jié)淀粉溶液的酸度在pH＝5.0。

2.1.3 淀粉溶液流速的影響

在流動注射化學(xué)發(fā)光測定中，由于淀粉溶液是在流經(jīng)酶柱時被酶催化發(fā)生反應(yīng)，流速的快慢會對淀粉的轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生一定的影響。在Luminol溶液的pH 9.0，淀粉溶液pH 5.0，酶柱溫度保持在55℃的條件下，按化學(xué)發(fā)光試驗方法分別測定由100 mg/L淀粉標(biāo)液在流速 2、4、6、8、10 r/min時所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4。

圖4 流速對發(fā)光強(qiáng)度的影響

由圖4可見，體系的發(fā)光強(qiáng)度隨淀粉溶液流速的增大而降低。流速越低，體系的發(fā)光強(qiáng)度越大。而體系的發(fā)光強(qiáng)度越大，測定的靈敏度就越高?？紤]到蠕動泵流速的均勻性及分析速度，選用淀粉溶液的流速為 2 r/min。

2.2 Luminol溶液酸度的選擇

在淀粉溶液pH 5.0、流速為2 r/min，酶柱溫度保持在55℃的條件下，按化學(xué)發(fā)光試驗方法分別測定100 mg/L淀粉標(biāo)液在 Luminol溶液 pH 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0時體系的發(fā)光強(qiáng)度，如圖 5所示。

圖5 Luminol溶液pH對發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖5表明，在Luminol溶液的pH 9.0左右時，體系的發(fā)光強(qiáng)度最大。選定Luminol溶液的pH 9.0。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在Luminol溶液 pH 9.0，淀粉溶液 pH 5.0、流速為2 r/min，酶柱溫度保持在55℃的條件下，按化學(xué)發(fā)光試驗方法分別測定由 1、10、30、60、100、150 mg/L淀粉標(biāo)液所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6。可見，淀粉溶液在1～150 mg/L的濃度范圍內(nèi)，體系發(fā)光強(qiáng)度與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。對50 mg/L淀粉標(biāo)液進(jìn)行10次測定的RSD為2.1%，由對10 mg/L淀粉標(biāo)液的測定結(jié)果，求得測定的檢測限為0.3 mg/L(信噪比 S/N＝3)。

圖6 淀粉的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.4 加標(biāo)回收率試驗

取5種樣品，經(jīng)預(yù)處理后按最佳試驗條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果(n＝5)

2.5 樣品測定和對比試驗

為了進(jìn)一步了解方法的準(zhǔn)確度，試驗分別用本法和國標(biāo)方法(酶水解法)對8個樣品進(jìn)行了對比測定，結(jié)果見表2。將測定結(jié)果用t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計分析，t＜t0.05.7，說明兩方法的測定結(jié)果無顯著性差異。

表2 樣品測定和對比試驗結(jié)果

2.6 酶柱的使用壽命

酶柱的使用壽命取決于酶從固定柱中流出的速度，因為這種流出將導(dǎo)致分析信號的減弱。本試驗在室溫條件下，考察了酶柱活性隨時間的變化情況。結(jié)果顯示，1個月內(nèi)至少使用了300次的酶柱所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度與新酶柱所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度沒有明顯的減弱，40天內(nèi)至少使用了350次的酶柱所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度仍保持新酶柱所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度的77%。說明在室溫條件下，固定化酶柱有較好的使用穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

作為生物酶固定化載體，MCM－41介孔分子篩有獨特優(yōu)勢。本試驗利用MCM－41介孔分子篩將α－淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶固定化，制成復(fù)合酶柱，將此酶柱用于流動注射化學(xué)發(fā)光分析體系，可用于淀粉含量的快速測定。酶柱的最佳使用條件為:柱溫55℃，淀粉溶液的pH 5.0、流速2 r/min。淀粉測定的線性范圍為1～150 mg/L，相關(guān)系數(shù)0.999 8，檢出限為0.3 mg/L，回收率為為97.2～102.2%，10次測定的RSD為2.1%。

方法具有多種優(yōu)點:樣品前處理簡單，操作簡便，節(jié)省酶試劑，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，測定速度快，單次測定能在1 min內(nèi)完成。對8個樣品的測定結(jié)果與國標(biāo)方法的測定結(jié)果無顯著性差異。為淀粉含量的測定提供了一種良好的新方法。

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