陳 璨，蔣冬花，齊育平，曹麗凌，黃 娜，孫 青

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

絲狀真菌(filamentous fungi)是一種重要的微生物，在生物技術(shù)領(lǐng)域有著舉足輕重的作用。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)，是分析基因組功能、了解真菌的重要方法之一，有效率高、轉(zhuǎn)化穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn);在ATMT的研究中，有 LBA1100、C58C1、EHA104、AGL-1 等多種根癌農(nóng)桿菌菌株的應(yīng)用，對(duì)大量研究結(jié)論進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，能反映不同菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。在近10年絲狀真菌轉(zhuǎn)化研究中，對(duì)根癌農(nóng)桿菌被使用的頻度、轉(zhuǎn)化效率等綜合評(píng)價(jià)，AGL-1菌株的優(yōu)勢(shì)更為顯著，為研究絲狀真菌提供了更方便的途徑。本文就根癌農(nóng)桿菌AGL-1菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化真菌種類、機(jī)理、方法、影響因素及其應(yīng)用作綜述。

1 AGL-1菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化絲狀真菌的機(jī)理

根癌農(nóng)桿菌是革蘭陰性土壤菌，屬于根癌菌科(Rhizobiacease)，農(nóng)桿菌屬(Agrobactrium)。能在自然條件下趨化性地侵染雙子葉植物的受傷部位，產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)生根。早在1995年，Bundock等就報(bào)道利用根癌農(nóng)桿菌對(duì)酵母菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，1998年De-Groot等首次報(bào)道了農(nóng)桿菌成功侵染黑曲霉(Aspergillus niger)等6種絲狀真菌，開啟了農(nóng)桿菌在真菌轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。農(nóng)桿菌侵染絲狀真菌與侵染植物相似，Vir基因活性激發(fā)，將其所攜帶的Ti質(zhì)粒上的一段T-DNA序列轉(zhuǎn)移到植物基因組 DNA 中。需要 VirA、VirB、VirC、VirD1/VirD2、VirE、VirF、VirG、和VirH 等一系列基因協(xié)同完成通路。初始由VirA基因編碼的蛋白A首先與植物傷口結(jié)合，行使感受蛋白功能，釋放酚類和糖類物質(zhì)，受環(huán)境刺激后將自身的組氨酸殘基磷酸化［1］。修飾后的蛋白A與VirG蛋白結(jié)合，將磷酸鹽轉(zhuǎn)到G蛋白天冬氨酸殘基上，從而激活VirG 蛋白。進(jìn)而激發(fā) VirB、VirC、VirD、VirE、VirH等一系列基因的表達(dá)。VirD1/D2起到DNA松弛酶的作用，將DNA超螺旋解旋為松弛狀態(tài)，且切開T-DNA邊界。VirD2蛋白將T-DNA 5'端切開并與之結(jié)合，其自身C-端的細(xì)胞核定位信號(hào)(Nuclear Localization Signal，NLS)引導(dǎo) T-DNA 進(jìn)入植物細(xì)胞并進(jìn)行定位，引導(dǎo)GUS蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。VirD蛋白結(jié)合在T-DNA右端下游，VirC基因調(diào)節(jié)VirD蛋白對(duì)T-DNA的切割作用。結(jié)合蛋白VirE與T-DNA單鏈形成復(fù)合體，VirB介導(dǎo)整段T-DNA通過(guò)農(nóng)桿菌細(xì)胞膜整合到植物基因組中，完成轉(zhuǎn)化。有報(bào)道稱單糖可在整個(gè)通路中起到促進(jìn)VirA和VirG蛋白激活與結(jié)合的作用，有研究者在轉(zhuǎn)化紅曲霉時(shí)發(fā)現(xiàn)加入糖類物質(zhì)反而使轉(zhuǎn)化效率降低甚至不能轉(zhuǎn)化，推測(cè)糖類物質(zhì)可能與轉(zhuǎn)化過(guò)程中基因表達(dá)有某種未知的作用。綜上所述，Vir基因的活性，是侵染真菌的關(guān)鍵，但由于菌株活力不同、侵染對(duì)象可能存在特定的機(jī)制，都直接影響轉(zhuǎn)化的成功與否，所以Vir毒力高的菌株，在ATMT中，有更高的應(yīng)用價(jià)值。

2 AGL-1菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化絲狀真菌的種類

利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌已有近30年的歷史，迄今已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了鐮刀菌(Fusarium)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等100余種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化。AGL-1菌株是根癌農(nóng)桿菌中重要的成員之一，據(jù)報(bào)道，通過(guò)其轉(zhuǎn)化成功的真菌有紫色紅曲霉(Monascus purpureus)，蛹蟲草(Cordyceps militaris)，哈茨木霉(Trichoderma hazianum)，側(cè)皮糙耳(Pleurotus ostreatus)等數(shù)十種。由于轉(zhuǎn)化效率與農(nóng)桿菌的菌株種類有著密切聯(lián)系，因此許多研究者都將多種農(nóng)桿菌菌株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行比較。其中，Kemppainen等轉(zhuǎn)化菌根真菌(Laccarua vucolor)的結(jié)果表明AGL-1菌株的轉(zhuǎn)化效率比LBA1100菌株高4倍。高興喜等利用AGL-1菌株和LBA4404菌株同時(shí)轉(zhuǎn)化木霉，前者成功而后者沒(méi)有得到轉(zhuǎn)化子。Yanhua Zhang等［2］轉(zhuǎn)化申氏孢子菌絲(Sporothrix schenckii)的實(shí)驗(yàn)表明，AGL-1菌株轉(zhuǎn)化效率是EHA105菌株的5倍，是LBA4404菌株的 10余倍。Flowers等同時(shí)用AGL-1菌株和C58C1菌株對(duì)禾谷刺盤孢菌(Colletotrichun graminicola)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示 AGL-1菌株的轉(zhuǎn)化效率顯著高于C58C1菌株的轉(zhuǎn)化效率。Park等在轉(zhuǎn)化寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectria parasitica)的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)AGL-1菌株的轉(zhuǎn)化效率明顯高于LBA1100菌株。說(shuō)明AGL-1菌株在轉(zhuǎn)化對(duì)象和轉(zhuǎn)化效率上均有著不同程度的優(yōu)勢(shì)。

3 AGL-1菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化絲狀真菌的影響因素

3.1 真菌的培養(yǎng)時(shí)間

絲狀真菌的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)孢子發(fā)育起到?jīng)Q定性作用，進(jìn)而影響根癌農(nóng)桿菌的侵染。近年來(lái)報(bào)道的真菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，大部分設(shè)置了培養(yǎng)時(shí)間作為轉(zhuǎn)化率的影響因素。蔡琪敏等［3］在利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化紅色紅曲霉(Monascus ruber)的實(shí)驗(yàn)中，將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為7～28 d。結(jié)果顯示紅曲在PDA上培養(yǎng)20 d時(shí)，有著最高的轉(zhuǎn)化效率;而培養(yǎng)7 d的紅曲霉，轉(zhuǎn)化率最低甚至無(wú)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生。袁遠(yuǎn)等利用農(nóng)桿菌EHA105菌株轉(zhuǎn)化培養(yǎng)8 d的稻瘟病菌，轉(zhuǎn)化率可達(dá)每膜(Φ7 cm的濾紙)約50個(gè)轉(zhuǎn)化子。劉鵬娟等利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化培養(yǎng)10 d的稻瘟病菌，以硝酸纖維素(NC)膜為轉(zhuǎn)化載體，獲得了5 000余株轉(zhuǎn)化子，同時(shí)擁有更高的轉(zhuǎn)化效率。黎明等［4］在黑曲霉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，選用4℃保存15 d和28℃培養(yǎng)3 d的樣品，結(jié)果顯示后者轉(zhuǎn)化率是前者的4.5倍。綜合大量文獻(xiàn)報(bào)道，雖然目前不能指出不同真菌培養(yǎng)時(shí)間與轉(zhuǎn)化率互作的機(jī)制，但可以明確的是，真菌本身的生長(zhǎng)狀況良好、發(fā)育周期正常是轉(zhuǎn)化成功的前提，轉(zhuǎn)化率的提高很大程度上是使真菌本身能正常繁殖。利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化成功的真菌，均有特定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度，在轉(zhuǎn)化時(shí)需要研究者做進(jìn)一步探究。

3.2 誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮濃度

乙酰丁香酮(acetosyingone，AS)在 ATMT中起到誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因表達(dá)的作用。通常以二甲基亞砜(DMSO)溶解，微孔濾膜過(guò)濾除菌，用于AGL-1菌株的誘導(dǎo)培養(yǎng)和共培養(yǎng)兩個(gè)階段。AS是ATMT過(guò)程中必不可少的，如果不使用則無(wú)法完成轉(zhuǎn)化。其濃度直接影響轉(zhuǎn)化率，在一定范圍內(nèi)，兩者成顯著正相關(guān)［5］。作為一種酚類化合物，AS濃度過(guò)高會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生傷害，適宜的濃度是保證良好轉(zhuǎn)化率的重要條件之一。劉剛等［6］轉(zhuǎn)化里氏木霉實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置AS為0～800 μmol/L的濃度梯度，結(jié)果表明在200～400 μmol/L之間有最高轉(zhuǎn)化率，AS 為0 μmol/L 和800 μmol/L 時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。在眾多以AGL-1菌株為轉(zhuǎn)化工具的研究中，AS有效使用濃度一般在50～200 μmol/L，有報(bào)道稱當(dāng)AS濃度高于320 μmol/L會(huì)對(duì)植物和真菌產(chǎn)生傷害，從而影響轉(zhuǎn)化效率。另有研究證明，預(yù)培養(yǎng)期間加入AS，在提高轉(zhuǎn)化效率的同時(shí)也增加了T-DNA的拷貝數(shù)，降低了單拷貝的比例。因此，對(duì)于期望得到高比例單拷貝轉(zhuǎn)化子的研究，預(yù)培養(yǎng)時(shí)期要謹(jǐn)慎使用AS［7］。

早在1984年，Shawch等人的試驗(yàn)表明，農(nóng)桿菌對(duì)酚類化合物具有趨化性，而且這種趨化性依賴于VirA和VirG基因。Melania等利用載體引入高活性的VirG基因，無(wú)AS也取得了理想的轉(zhuǎn)化效率。因此陳東亮等認(rèn)為AS的作用只是誘導(dǎo)Vir基因活性，而與T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)關(guān)。Turkschj等曾報(bào)道過(guò)AS受體區(qū)域分布在VirA蛋白的第283～304氨基酸區(qū)段之間的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)。而VirA基因和AS之間的作用方式還不是十分清楚，需要作更深入研究。

3.3 AGL-1菌株與真菌共培養(yǎng)時(shí)間和溫度

高Vir毒性的AGL-1菌株與真菌共培養(yǎng)時(shí)間和溫度是重要的條件之一，T-DNA剪切、轉(zhuǎn)移和整合需要一定時(shí)間和特定溫度條件才能完成。適當(dāng)延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間會(huì)提高轉(zhuǎn)化率，Yang Ying-qing等［8］在水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)時(shí)間分別為 12、16、20、24、36 h，其中36 h達(dá)到67轉(zhuǎn)化子/皿，為最高的轉(zhuǎn)化效率。郭慧等［9］轉(zhuǎn)化日本曲霉時(shí)設(shè)置 1、2、3、4、5、6 d 6 個(gè)時(shí)間梯度，結(jié)果顯示共培養(yǎng)3 d為最佳培養(yǎng)時(shí)間。Leclerque等在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為3 d和4 d，轉(zhuǎn)化效率分別為121個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)細(xì)胞和163個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)細(xì)胞。但過(guò)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，會(huì)造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生、農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過(guò)密和T-DNA的多拷貝，對(duì)挑取和篩選造成麻煩［10］。通過(guò)近年來(lái)幾個(gè)研究小組用農(nóng)桿菌AGL-1菌株轉(zhuǎn)化不同絲狀真菌的研究，初步得出AGL-1菌株共培養(yǎng)時(shí)間大概在2～3 d。

共培養(yǎng)溫度是轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵，在保證AGL-1菌株的Vir基因能表達(dá)的同時(shí)，需要兼顧真菌孢子的生長(zhǎng)狀況。早期的研究表明，較高的溫度不利于農(nóng)桿菌所攜帶的T-DNA轉(zhuǎn)入植物和形成腫瘤。郭慧等［9］對(duì)日本曲霉的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)置了20、24、28℃，結(jié)果表明24℃為最佳。張林平等［11］利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化異角狀擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis heterocor－nis)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了 20、25、30、35℃ 4個(gè)梯度，其中25℃有著最高的轉(zhuǎn)化效率。Md.Nazrul Islam 等［12］在尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了 20、25、28℃ 3個(gè)溫度，轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)分別為14個(gè)/皿、18個(gè)/皿、9個(gè)/皿。據(jù)近年來(lái)學(xué)者利用AGL-1菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究，初步得出AGL-1菌株轉(zhuǎn)化絲狀真菌的共培養(yǎng)溫度與植物相似，在22～25℃左右，過(guò)低或過(guò)高的溫度都不利于Vir基因的表達(dá)，有研究表明AGL-1菌株在28℃以上就喪失Vir基因表達(dá)的能力。

3.4 AGL-1菌株菌液濃度與真菌孢子數(shù)比例

AGL-1菌株菌液濃度與真菌孢子數(shù)的比例，對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定影響。農(nóng)桿菌濃度較低時(shí)，真菌孢子不能與AGL-1菌株充分接觸，使轉(zhuǎn)化基數(shù)下降。農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，AGL-1菌株與真菌孢子接觸飽和，但菌量過(guò)多、過(guò)分繁殖，在共培養(yǎng)基中占用轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)資源，甚至農(nóng)桿菌覆蓋長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，反而使轉(zhuǎn)化率下降，且可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子無(wú)法挑出篩選。孢子量過(guò)多也會(huì)造成萌發(fā)時(shí)生長(zhǎng)相互接觸，連成一片，不利于挑出。所以利用ATMT法進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，純粹追求轉(zhuǎn)化率最高是不現(xiàn)實(shí)也是不合理的。丁興等利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化紫色紅曲(Monascus purpureu)孢子過(guò)程中，以農(nóng)桿菌濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明紅曲孢子數(shù)106個(gè)/mL時(shí)有較高的轉(zhuǎn)化率，1.35×108個(gè)/mL的AGL-1菌株與紅曲孢子數(shù)106個(gè)/mL等體積混合(孢子∶農(nóng)桿菌=1∶135)，出現(xiàn)最高的轉(zhuǎn)化率每平皿120個(gè)，過(guò)高或過(guò)低的比例均呈轉(zhuǎn)化率下降。劉朋娟等也利用孢子數(shù)106個(gè)/mL的稻瘟病菌與OD600為0.5～0.6的 AGL-1菌株等體積混合，獲得了轉(zhuǎn)化子300個(gè)/mL混合菌液的轉(zhuǎn)化率。莊靜娜等［13］在利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化紫色紅曲時(shí)，利用了OD600約為0.5的AGL-1菌株，稀釋紅曲孢子數(shù)約為104，獲得了相對(duì)較高且適合挑取的轉(zhuǎn)化率。綜合近年來(lái)利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化絲狀真菌的研究，初步可以得出，大部分轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中真菌孢子數(shù)在104～106/mL，AGL-1菌株在 OD600為0.5左右，2種菌液等體積混合，可以得到較高轉(zhuǎn)化率的同時(shí)具有良好的可操作性。

3.5 其他影響因素

真菌分生孢子在大量的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用頻繁，另外原生質(zhì)體和菌絲也是利用AGL-1菌株轉(zhuǎn)化的可選材料。不同的材料存在不同的組織結(jié)構(gòu)和生理特性，因此轉(zhuǎn)化方式和轉(zhuǎn)化率也是不同的。原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁，因而AGL-1菌株更易侵染，得到更高的效率。但原生質(zhì)體制備繁瑣，分生孢子只用無(wú)菌水洗，過(guò)濾除去菌絲即可，操作簡(jiǎn)單。并且有報(bào)道稱孢子作為材料時(shí)，也能取得較理想的轉(zhuǎn)化效率，有的甚至達(dá)到原生質(zhì)體的水平。部分真菌所具有的細(xì)胞核，比真核生物的小，且形態(tài)變化大，能通過(guò)隔膜中的小孔在菌絲中快速移動(dòng)。因而利用真菌多核菌絲作為材料，可能造成后代的分化，所得轉(zhuǎn)化子不如單核的穩(wěn)定。Richard等利用預(yù)萌發(fā)處理的孢子和未經(jīng)過(guò)預(yù)萌發(fā)處理的孢子轉(zhuǎn)化核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，結(jié)果顯示兩者的轉(zhuǎn)化效率無(wú)明顯差異，但經(jīng)過(guò)預(yù)萌發(fā)處理的孢子具有多核，后代遺傳穩(wěn)定性較差。

載體是轉(zhuǎn)化過(guò)程中的直接參與者，不同的載體有著不同的空間結(jié)構(gòu)和屬性，與參與轉(zhuǎn)化的酶種類和活性有密切聯(lián)系［14］。Campoy等利用pUR5750載體轉(zhuǎn)化紅曲霉的效率是pBGgHg載體的2倍，且利用pBG7-1轉(zhuǎn)化不成功。Godior等利用pBGgHg載體和pBG7-1載體(兩者只有啟動(dòng)子不同)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果 pBGgHg轉(zhuǎn)化成功，而pBG7-1轉(zhuǎn)化失敗。在AGL-1菌株的應(yīng)用中，王梅娟等［15］構(gòu)建玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化庫(kù)時(shí)，成功使用了雙價(jià)載體質(zhì)粒 pBHtl，它將 pCAMBIA1300骨架中的 pCaMV35S-hph置換為 pTrpc-hph。Javier等利用分別含有psk1019載體和pCAM-BIA1300載體的AGL-1菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化交織頂孢霉(Acremonium implicatum)，發(fā)現(xiàn)前者的轉(zhuǎn)化效率是后者的數(shù)百倍。目前每種真菌適合的載體并不統(tǒng)一，需要研究人員進(jìn)行不同嘗試。

轉(zhuǎn)化中用于共培養(yǎng)的載體有硝酸纖維素膜(NC)、玻璃紙、雜交膜、濾紙、尼龍膜等。不同的承載膜有不同的通透性，對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定影響。有研究利用Hybond-N+雜交膜為介質(zhì)轉(zhuǎn)化致病疫霉(Phytophthora infestans)，其轉(zhuǎn)化效率是用尼龍膜Nytran的2～3倍。另有報(bào)道利用玻璃紙和NC膜轉(zhuǎn)化紅曲菌，兩者轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差別，但用濾紙則轉(zhuǎn)化率明顯下降。

農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的IM培養(yǎng)基，和共培養(yǎng)階段的Co-IM培養(yǎng)基的pH值，將直接影響農(nóng)桿菌Vir基因的活性。pH值在5.0～5.8比較適合AGL-1菌株Vir基因的表達(dá)。Zhuangli Zheng等［16］在利用 AGL-1菌株轉(zhuǎn)化蛹蟲草(Cordyceps militaris)的實(shí)驗(yàn)中得出，pH值在5.5時(shí)有較高的轉(zhuǎn)化率，在5.0和6.0時(shí)均呈下降趨勢(shì)。初步統(tǒng)計(jì)近年來(lái)的研究，絲狀真菌轉(zhuǎn)化中一般pH值在5.2 左右。

4 AGL-1菌株的特性與轉(zhuǎn)化真菌的技術(shù)路線

通過(guò)上述分析，根癌農(nóng)桿菌AGL-1是1株具有高Vir基因活性，侵染能力強(qiáng)，適用范圍廣的菌株。在ATMT法轉(zhuǎn)化真菌的應(yīng)用中被廣泛使用，與其他菌株的比較表現(xiàn)出不同程度的優(yōu)勢(shì)。過(guò)去近10年的研究里，越來(lái)越多的真菌被成功轉(zhuǎn)化，積累了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為研究其他真菌轉(zhuǎn)化條件提供了參考。經(jīng)過(guò)以上對(duì)各種因素的分析，可以了解到其轉(zhuǎn)化技術(shù)路線:AGL-1菌株在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中28℃活化2～3 d，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)到OD600約為0.15。離心得菌體，加入含有50 ～200 μmol/L AS、pH 值 5.0 ～5.8的 IM培養(yǎng)基，菌懸液培養(yǎng)至OD600約為0.5。以無(wú)菌水洗下培養(yǎng)適宜時(shí)間的真菌孢子，經(jīng)4層擦鏡紙過(guò)濾，去除菌絲及雜質(zhì)，制成105個(gè)/mL左右的孢子懸液。2種懸液等體積混勻，涂布于貼在Co-IM培養(yǎng)基的承載膜上，25℃培養(yǎng)2～4 d。將膜揭下貼于含有頭孢霉素和篩選物質(zhì)的平板上。待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，挑取單菌到篩選平板上，并轉(zhuǎn)接5～6次，驗(yàn)證遺傳穩(wěn)定性。之后可通過(guò)T-DNA上序列設(shè)計(jì)引物，觀察 PCR產(chǎn)物大小，驗(yàn)證 T-DNA的插入。

5 應(yīng)用和展望

近年來(lái)對(duì)真菌的研究越來(lái)越多，ATMT法本身的技術(shù)優(yōu)勢(shì)不斷表現(xiàn)出來(lái)，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。ATMT法轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化原材料多樣，在改變菌種遺傳特性、功能特性、甚至賦予其本身不具有的功能等方面有著突出的優(yōu)勢(shì)。真菌對(duì)于保健品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域有著重要意義，而優(yōu)質(zhì)工程菌的開發(fā)和利用是提高生產(chǎn)效能、產(chǎn)研結(jié)合的重要途徑［17］。在真菌基因功能的研究方面，基因剔除和定點(diǎn)突變等反向遺傳學(xué)手段是人們認(rèn)識(shí)基因功能最直接的工具［18-20］。由于Ti質(zhì)粒中的T-DNA與真菌基因組有同源序列時(shí)，會(huì)發(fā)生同源重組，所以在已知真菌序列的情況下，將目標(biāo)基因的已知序列克隆在T-DNA上，構(gòu)建成為打靶載體。攜帶這種載體的AGL-1菌株在侵染真菌時(shí)，會(huì)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行沉默和更換，使真菌表現(xiàn)型發(fā)生變化，從而探索基因功能。在根據(jù)表現(xiàn)型尋找功能基因時(shí)，AGL-1菌株介導(dǎo)T-DNA隨機(jī)插入真菌基因組中，構(gòu)建數(shù)量足夠的轉(zhuǎn)化庫(kù)，篩選出表現(xiàn)型改變的轉(zhuǎn)化子。根據(jù)T-DNA的已知序列，利用hiTAIL-PCR技術(shù)可快速克隆出其左右端功能序列，且效率比過(guò)去的TAIL-PCR提高了90%［21］。在培養(yǎng)無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因生物研究中，利用根癌農(nóng)桿菌可攜帶不同載體，和T-DNA可在不同位點(diǎn)攜帶多個(gè)基因的特點(diǎn)，將選擇標(biāo)記基因和安全的功能基因同時(shí)轉(zhuǎn)化到同一個(gè)轉(zhuǎn)化子中。由于2個(gè)基因存在于不同位點(diǎn)，通過(guò)轉(zhuǎn)化子的分化，篩選出不含標(biāo)記基因的后代。可得到不影響轉(zhuǎn)基因功能且沒(méi)有篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因真菌。ATMT法與熒光顯色技術(shù)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)化載體中加入熒光蛋白基因，可在植物和真菌存活的情況下，探究蛋白質(zhì)合成以及追蹤相關(guān)生理生態(tài)活動(dòng)［22］，也是目前熱門的研究方法之一。總之，ATMT法是研究植物和真菌高效、簡(jiǎn)便的方法，過(guò)去的近30年中有著大量的研究成果，并且還會(huì)有更大的潛力可以發(fā)掘，發(fā)揮更重要作用。根癌農(nóng)桿菌AGL-1菌株是ATMT法中重要的參與者，有著高Vir毒力的特點(diǎn)，在真菌研究中使用廣泛，轉(zhuǎn)化高效、穩(wěn)定，具有較好的應(yīng)用前景。

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