熊 霞 楊煥勝 印遇龍

(中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125)

真菌毒素是真菌在應(yīng)激下產(chǎn)生的高毒性低分子質(zhì)量的二級代謝物，對人類和動物健康具有潛在危害。真菌毒素對作物(小麥、大麥、燕麥、玉米等)的污染是一個全球性的問題，導(dǎo)致了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中的重大經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，大概全球25%的作物被真菌毒素污染[1]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素，主要由鐮刀菌(Fusarium spp.)產(chǎn)生。這種毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在加工過程中一般不易破壞，很易于在人類的食品和動物的飼料中找到。

腸黏膜是機體與病原體和毒素接觸的第1道屏障，腸道單層柱狀細(xì)胞(腸上皮細(xì)胞)通過頂端連接復(fù)合體彼此連接。連接復(fù)合體可阻止異型生物質(zhì)和微生物進(jìn)入到機體，但允許營養(yǎng)物質(zhì)和維持機體穩(wěn)態(tài)和生長的物質(zhì)通過[2]。DON、赭曲霉毒素A和棒曲霉素這3種毒素是有名的腸道致病性真菌毒素，它們能改變腸道功能，導(dǎo)致營養(yǎng)不良、腹瀉、嘔吐和腸道炎癥[3]。腸道是 DON吸收的主要部位，如自然霉變的小麥進(jìn)入豬體內(nèi)后大概15 min即可在血液中檢測到DON的存在，并在(1.65±0.79)h時濃度可達(dá)到峰值，表明DON能被快速和幾乎完全地吸收[吸收率達(dá)(91.5±27.4)%][4]。攝入中到高劑量的DON如何影響免疫系統(tǒng)已經(jīng)很清楚[1]，但目前對DON在腸道中的作用機制了解甚少。近年來的研究表明，DON抑制了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，破壞腸道屏障和細(xì)胞緊密連接，引起了腸道炎癥，并改變了腸道微生物組成。本文將圍繞DON對腸道屏障的影響及其作用機制進(jìn)行綜述。

1 DON影響腸上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

含真菌毒素的飼料被動物機體消化后，首先與腸道上皮細(xì)胞接觸。腸道對營養(yǎng)物質(zhì)(如葡萄糖和氨基酸等)的吸收主要是通過細(xì)胞內(nèi)途徑，少量是由旁細(xì)胞通路途徑進(jìn)入。轉(zhuǎn)運蛋白利用電化學(xué)梯度把葡萄糖、氨基酸和離子運輸過質(zhì)膜，但DON影響營養(yǎng)物質(zhì)特別是葡萄糖的吸收。Hunder等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂大鼠10 mg/kg的DON 6周后極大地降低了大鼠腸道對葡萄糖的吸收。Maresca等[6]研究表明，低濃度(＜ 10 μmol/L)DON 選擇性調(diào)節(jié)人腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運載體的活性，而10 μmol/L的DON處理腸上皮細(xì)胞48 h后顯著抑制葡萄糖鈉離子依賴性轉(zhuǎn)運載體(SGLT1)和果糖轉(zhuǎn)運載體(GLUT5)的活性。該結(jié)果提示DON抑制蛋白質(zhì)合成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是DON對腸上皮細(xì)胞毒性的主要作用機制。Award等[7]通過尤斯灌流室(Ussing chamber)檢測發(fā)現(xiàn)，添加L-脯氨酸能增加雞腸黏膜上的短路電流，但添加DON后則抑制了該短路電流。該結(jié)果提示DON能干擾氨基酸轉(zhuǎn)運載體活性。但Zerull等[8]發(fā)現(xiàn)，5.7 mg/kg的DON并未對豬空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運載體蛋白的合成產(chǎn)生影響，原因可能是5.7 mg/kg的DON劑量并不能影響到腸道轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。目前DON對一些特定腸道氨基酸轉(zhuǎn)運的干擾主要是發(fā)生在RNA轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)合成水平還不太清楚。DON進(jìn)入機體后主要是在胃到空腸近端處被快速和有效地吸收，少部分到達(dá)小腸下端和大腸[9]，并通過腸道微生物脫環(huán)氧化代謝成毒性小的去環(huán)氧DON(DOM-1)，因此DON對大腸毒性作用較小。

2 DON對腸道屏障和細(xì)胞緊密連接的影響

腸道是抵御外來抗原入侵的最重要部位，胃腸道(從胃到結(jié)腸)屏障排列著連續(xù)的單層腸上皮細(xì)胞，其首要功能就是作為物理屏障隔離來自腸腔的有害物質(zhì)[10]。腸上皮細(xì)胞通過位于相鄰上皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junction)與黏著連接(adherens junction)、縫隙連接(gap junction)和橋粒(desmosome)共同組成連接復(fù)合物。緊密連接位于連接復(fù)合體的最頂端，限制物質(zhì)通過旁細(xì)胞通路轉(zhuǎn)運。腸上皮細(xì)胞通過細(xì)胞連接進(jìn)行緊密黏附，限制了小的親水分子的旁路轉(zhuǎn)運。跨膜蛋白如緊密連接蛋白家族(claudins)和胞漿蛋白如閉鎖帶蛋白家族(zonula occludens)等維持了屏障的完整性，而DON毒性的一個重要方面是損傷腸道屏障。腸上皮細(xì)胞除了維持屏障功能外，還發(fā)展了多種機制防御外來抗原入侵，包括黏液分泌、抗菌肽合成和參與細(xì)胞因子/趨化因子網(wǎng)絡(luò)等[11]。

眾所周知，DON是RNA、DNA和蛋白質(zhì)合成的潛在抑制劑。DON與60S核糖體亞基中的肽基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，誘導(dǎo)了所謂的“核糖體失活反應(yīng)(ribotoxic stress response)”，激活了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[12]。MAPK通路中的信號分子能調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能[13]。MAPK信號通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分。目前細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)/大絲裂原活化蛋白激酶-1(BMK1)等4個MAPK亞族在哺乳動物細(xì)胞中被克隆和鑒定。不同MAPK亞族被其上游激酶激活后，可通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和酶類等多種底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程，包括傳導(dǎo)下游的免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡信號[14]。Van de Walle等[15]發(fā)現(xiàn) DON通過抑制蛋白質(zhì)合成影響腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，從而破壞腸道屏障，但其內(nèi)在機制并不清楚。Pinton等[16]發(fā)現(xiàn)DON能誘導(dǎo)P44/42 ERK信號通路的激活，抑制緊密連接蛋白-4的表達(dá)，從而導(dǎo)致腸屏障功能受損。但目前人們對核糖體反應(yīng)中的上游激酶如何被激活并不清楚。小腸上皮細(xì)胞單分子膜的跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant，TER)被認(rèn)為是上皮完整性和組織細(xì)胞單分子層緊密連接程度的一個重要指標(biāo)。緊密連接蛋白表達(dá)的變化可能會減少上皮細(xì)胞層的TER，導(dǎo)致了細(xì)胞單分子層通透性的增加，增加了旁細(xì)胞通路轉(zhuǎn)運和超大分子的吸收，增加了細(xì)菌移位的機會。Sergent等[17]的研究表明，DON在腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運主要是通過細(xì)胞旁路被動擴散，少部分是跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運。長時間暴露于DON能引起MAPK信號通路中ERK1/2、p38和應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)/JNK的磷酸化，減少人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞(CaCo-2)的TER，引起腸道炎癥。

3 DON對腸上皮細(xì)胞的其他影響

IPEC-J2是從未哺乳的新生仔豬空腸分離的腸上皮細(xì)胞，是非轉(zhuǎn)化型的起始連續(xù)培養(yǎng)小腸細(xì)胞系，具有典型的豬小腸上皮細(xì)胞特性，是研究營養(yǎng)素等物質(zhì)與小腸上皮細(xì)胞間作用機制的良好模型[18]。Diesing 等[19]用不同劑量(200和2000ng/mL)的DON處理豬IPEC-1和IPEC-J2，發(fā)現(xiàn)高劑量的DON能對這2種細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，包括對細(xì)胞的活性、分化、緊密連接和周期等都有影響;而低劑量的DON對細(xì)胞的影響很小，表明了低劑量與高劑量的DON在腸上皮細(xì)胞上的作用機制不同。此外，Accensi等[20]在斷奶仔豬上的試驗表明，低劑量(0、280、560 和 840 μg/kg)的DON并未對豬的血液生化以及免疫各指標(biāo)產(chǎn)生影響。該結(jié)果與Doll等[21]的研究結(jié)果一致，這些結(jié)果能為豬飼料中DON的最低檢測限提供依據(jù)。此外，DON對動物的影響與飼料受污染程度、動物的年齡以及飼養(yǎng)期有關(guān)[22]。Pestka[23]的研究表明，真菌毒素同時具備免疫激活或免疫抑制功能，這與劑量、頻率、暴露時間以及免疫細(xì)胞的類型有關(guān)。腸上皮細(xì)胞的極化結(jié)構(gòu)對于其功能的行使極為重要，腸上皮細(xì)胞基頂膜和基底膜分工各有不同?；斈ど虾写罅康拿负娃D(zhuǎn)運載體復(fù)合物，如乳糖酶、蔗糖酶和氨基肽酶等，協(xié)助腸腔營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收。而基底膜上主要以營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸或糖的轉(zhuǎn)運載體為主。DON被腸道吸收時與上皮細(xì)胞在基頂側(cè)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)入到血液中的DON則通過血液與腸上皮細(xì)胞基底側(cè)接觸。Diesing等[9]檢測了DON對 IPEC-J2細(xì)胞活力和緊密連接的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同的DON濃度從基底側(cè)接觸比基頂側(cè)對腸道屏障的完整性破壞更嚴(yán)重。此外，為了維持腸道屏障功能，上皮需要持續(xù)更新。來源于隱窩干細(xì)胞的腸上皮細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸向絨毛端遷移，遷移過程逐漸分化為成熟的腸上皮細(xì)胞，并最終在絨毛頂端脫落，分化成熟后的腸上皮細(xì)胞有著顯著的頂角結(jié)構(gòu)和上千個微絨毛[24]。動物研究中把腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)(上皮細(xì)胞增殖、隱窩深度和絨毛高度)作為檢測動物是否健康的一個指標(biāo)。Maresca等[6]的研究表明DON能影響人結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖。

4 DON對腸道炎癥和腸道微生物組成的影響

目前很多研究集中在DON污染的食物或飼料對胃腸道的直接影響，盡管它們對腸道屏障和轉(zhuǎn)運活性的影響已經(jīng)逐漸明確，但目前人們對它們的促炎機理仍知之甚少。腸上皮細(xì)胞對外界各種刺激分泌出炎性介質(zhì)，激活腸上皮細(xì)胞以下的免疫細(xì)胞，觸發(fā)腸道黏膜防御中的炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是DON的作用靶標(biāo)。細(xì)胞因子是小肽分子，它們對于調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)非常重要，由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生。Mbandi等[25]研究表明，DON具有促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞趨化因子和促炎細(xì)胞因子，包括白介素 -1β(IL-1β)、白介素 -6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-2)表達(dá)的作用。Maresca等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DON通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-1β活性或增加腸道共生大腸桿菌的跨膜通道，間接刺激白介素-8(IL-8)的分泌。這些結(jié)果表明，DON對腸道不僅具有直接的促炎作用，也可通過腸道屏障功能改變而間接引起腸道炎癥。Van de Walle等[26]在Caco-2細(xì)胞上的研究表明，DON能誘導(dǎo)活化核因子-κB(NF-κB)的活化及刺激IL-8的分泌，并存在劑量依賴性。而這2個因子刺激了促炎，提示高劑量的DON可能導(dǎo)致或加劇腸道炎癥。Vandenbroucke等[27]研究了低濃度的DON與鼠傷寒沙門氏菌誘發(fā)的早期腸道炎癥之間的關(guān)系，結(jié)果表明，攝入DON污染的食物或飼料后，可能導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞更容易被病原體如沙門氏菌侵入，而且加重了后續(xù)的腸道炎癥。Noqueira等[28]通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究了人的2種淋巴細(xì)胞系在DON處理后蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)包含在蛋白酶體降解途徑中蛋白質(zhì)的上調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄因子的激活以及細(xì)胞因子的變化有關(guān)。

此外，腸道菌群是影響動物健康的一個重要因素，機體的免疫反應(yīng)與腸道菌群發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物間有著密切關(guān)系[29]。有研究者通過體外試驗調(diào)查了腸道菌群和單端孢霉菌毒素之間的相互作用，以確定菌株是否能減少霉菌毒素的毒理效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選的細(xì)菌能與DON結(jié)合，并通過脫環(huán)氧化作用降低的毒性作用[30-31]。Wache 等[32]首次通過毛細(xì)管電泳單鏈構(gòu)象多態(tài)性(CE-SSCP)在體研究了DON對腸道微生物的影響，發(fā)現(xiàn)DON改變了腸道微生物的組成。

5 小結(jié)

腸道是抵抗病原體和微生物入侵的第1道屏障，開展DON對腸道屏障的影響及其作用機制的研究對于調(diào)節(jié)人類和動物的健康非常有意義。抑制蛋白質(zhì)合成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是DON的毒性機理之一，此外，它還可以通過減少細(xì)胞緊密連接蛋白來破壞腸道屏障。然而，目前對DON介導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的作用機制如“核糖體失活反應(yīng)”中對上游激酶激活的影響、抗菌肽的產(chǎn)生等仍然了解甚少，其詳細(xì)機制需要進(jìn)一步的研究。在今后的研究中，應(yīng)該結(jié)合分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)等各種技術(shù)和方法，從細(xì)胞和分子水平進(jìn)行深入研究，以深入揭示DON的作用機理。

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