張 玲 楊彩梅* 曹廣添 肖英平 曾新福

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310029;2.浙江惠嘉生物科技有限公司，杭州 310030)

天然免疫應(yīng)答是通過抗原呈遞細胞(APC)識別吞噬病原體進行降解并呈遞給T細胞來啟動獲得性免疫應(yīng)答，同時通過合成炎性因子和細胞因子引發(fā)炎癥性反應(yīng)[1]。在天然免疫的識別過程中，免疫細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)特異地識別病原微生物進化中保守的抗原分子，即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，從而有效地監(jiān)測病原微生物的入侵以及誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)[2]。Toll樣 受 體 (Toll-like receptors，TLRs)是PRRs中重要的一種，它能識別抗原引發(fā)天然免疫，使免疫細胞釋放細胞因子，從而介導(dǎo)獲得性免疫，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。

1 TLRs結(jié)構(gòu)與種類、配體以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

1.1 TLRs結(jié)構(gòu)與種類

TLRs是識別病原體PAMP的一種Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)為含有亮氨酸重復(fù)的序列(LRR)，參與識別各種病原體;跨膜區(qū)為富含半胱氨酸的區(qū)域;胞內(nèi)區(qū)含有Toll樣同源結(jié)構(gòu)域和分子羧基端長短不同的短尾肽組成。Toll樣同源結(jié)構(gòu)域與白介素1受體(IL-1R)胞漿結(jié)構(gòu)域有高度同源性[1-3]。

Medzhitov等[4]鑒定并克隆了一種人的果蠅Toll同源體——TLR4。迄今為止，已經(jīng)至少發(fā)現(xiàn)11種人的 TLRs(TLR1～TLR11)和13種鼠的TLRs(TLR1～TLR13)。鼠體內(nèi) TLR10沒有功能，而TLR11有功能;人的TLR11基因由于存在終止密碼子，因此不能翻譯表達，所以沒有功能。據(jù)報道，家禽中雞的 TLRs有 10種，分別為chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15 和chTLR21。其中chTLR1LA、chTLR1LB 和chTLR15是禽類特有的。另外，研究還表明chTLR1、chTLR2、chTLR7存在基因倍增的現(xiàn)象[4-6]。據(jù)于高水等[7]報道TLR14和TLR15也相繼在小鼠和雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。

1.2 TLRs配體

TLRs通過識別病原體表面的PAMP來引發(fā)免疫反應(yīng)。不同的TLRs識別不同的配體。其中，TLR1主要識別細菌的三酰基肽;TLR2主要識別細菌肽聚糖(PGN)和脂多糖(LPS);TLR3主要識別病毒雙鏈RNA;TLR4主要識別LPS;TLR5主要識別細菌鞭毛蛋白;TLR7和TLR8可以識別單鏈RNA。

對雞的TLRs配體研究還不甚成熟，最近有一些研究報道表明，chTLR1與chTLR2之間存在相互作用;chTLR1LB與chTLR2A協(xié)同識別肽聚糖;chTLR1LB和chTLR2A的重組體可以識別細胞膜上的脂蛋白Mapl-2并活化巨噬細胞;chTLR2A和chTLR1LA重組體可以識別三酰脂蛋白Pam3[6]。細胞中的chTLR2B與chTLR1LA重組體可以識別三酰多肽Pam3CSK4和二酰多肽FSL-1，產(chǎn)生應(yīng)答并 活 化 細 胞 的 核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 κB(NF-κB);chTLR2B與CD14或淋巴細胞抗原96(MD2)結(jié)合后亦能夠識別LPS;因此chTLR2具有TLR2和TLR4二者的功能，chTLR2受體單體都不能誘導(dǎo)NF-κB的活化;chTLR15與鼠傷寒沙門氏菌有關(guān)，并且與易感染雞品系有關(guān)，未找到其配體[8]。此外，chTLR21可以識別CpG島以及未甲基化的寡聚核苷(ODN)[4，6]。

1.3 TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

TLRs一旦識別并結(jié)合PAMP就會導(dǎo)致下游信號事件和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)激活，從而誘導(dǎo)抗微生物分子、化學(xué)趨化因子、細胞因子和共刺激分子的基因表達，從而激活天然免疫和獲得性免疫。經(jīng)研究表明，TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括2種:一種是髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑，主要介導(dǎo)炎性細胞因子的產(chǎn)生;另一種是非MyD88依賴途徑，介導(dǎo)調(diào)節(jié)樹突狀細胞(DC)的成熟以及其他免疫調(diào)節(jié)分子(如MHC、CD80等)的基因表達。研究還表明現(xiàn)有TLRs中除了TLR3不是通過MyD88依賴途徑以外，其他受體均可通過MyD88途徑進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-3，7，9-13]。

以下是MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:當(dāng)TLRs的胞外區(qū)域與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)區(qū)與MyD88分子結(jié)合，緊接著MyD88分子與IL-1R相關(guān)蛋白激酶(IRAK)結(jié)合，然后腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)通過與IRAK-1結(jié)合而被激活，同時與泛素結(jié)合酶13(Ubc13)和泛素結(jié)合酶樣蛋白1A(Uev1A)異二聚體形成復(fù)合物，催化K63泛素合成，K63泛素與聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長因子激活的蛋白激酶1(TAK1)和TAK1結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合，直接激活TAK1;IκB激酶[IKK，包括催化亞基 IKKα、IKKβ以及調(diào)節(jié)亞基IKKγ(NEMO)]被募集到達TAK1，從而使 NF-κB 從 IκB 與 NF-κB 復(fù)合物中釋放，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，啟動炎癥應(yīng)答、細胞增殖或細胞分化。TAK1亦能磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)家族，從而活化c-Jun氨基末端激酶(JNK)/活化蛋白1(AP-1)途徑。同時，在漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、TLR7、TLR8、TLR9活化后還存在一條pDC特異性通路，這條通路是MyD88依賴的，涉及干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF-7)的活化和核轉(zhuǎn)位。

MyD88的非依賴途徑:此途徑主要是指TLR受體不通過MyD88分子而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這條途徑僅僅被TLR3、TLR4[含干擾素β的TIR結(jié)構(gòu)域(TRIF)]及TLR5利用。TRIF活化已結(jié)合IKKi的TBK1，調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)的活化和核轉(zhuǎn)位，最終使干擾素β基因表達;經(jīng)由MyD88非依賴途徑的TLR4信號要求一個橋梁接頭分子TRAM，經(jīng)由TRIF活化受體交互作用蛋白(RIP1)或TRAF6導(dǎo)致NF-κB活化;而TLR5則直接募集TRIF，經(jīng)TRAF6活化NF-κB接頭分子。

2 益生菌的免疫作用

益生菌是指可以直接飼喂動物，并對宿主消化道內(nèi)微生物平衡起有益作用的活的微生物。能夠增強動物對腸道內(nèi)有害微生物群落的抑制作用，或者通過增強非特異性免疫功能來預(yù)防疾病，從而間接起到促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用[14]。近年來的研究表明，益生菌可以調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)菌群平衡;刺激機體特異性或非特異性免疫機制，提高機體抗病能力和免疫力等作用[15-18]。

益生菌對機體的免疫作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:1)益生菌可以促進免疫器官的發(fā)育。李亞杰[14]研究表明，乳酸桿菌、芽孢桿菌可以顯著提高雞脾臟、法氏囊和胸腺等的器官指數(shù)。馬春全[19]研究表明，雛雞服用乳酸桿菌和乳酸鏈球菌復(fù)合菌制劑，其胸腺、脾臟指數(shù)于服用4～10 d、法氏囊指數(shù)于服用7 d明顯高于相應(yīng)對照雛雞。2)益生菌可以增強機體非特異性免疫和特異性免疫。益生菌可以增加B細胞的數(shù)量并且能提高抗體免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、分泌型IgA(SIgA)的水平，抑制免疫球蛋白E(IgE)水平升高;同時益生菌提高白介素7(IL-7)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)等細胞因子的水平[19-21]。錢程[22]研究表明，青春雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌對血清溶菌酶的產(chǎn)生具有刺激作用，并且能提高巨噬細胞的功能。Haller等[23]研究表明，乳酸桿菌能促進人外周血腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白介素12(IL-12)、白介素18(IL-18)等免疫細胞因子的生成。益生菌可以增加T細胞的數(shù)量并且促進T細胞的增殖;劉婷婷等[24]研究表明，丁酸梭菌可以提高溶菌酶活性及補體3(C3)水平。3)益生菌可以作為免疫佐劑。邵悅[20]和李琰[25]研究表明，益生菌能增強免疫器官對雞新城疫(ND)疫苗的細胞和體液免疫應(yīng)答，分泌細胞因子和大量特異性抗體，增強ND疫苗的免疫效果。

3 TLRs信號通路與益生菌免疫作用的關(guān)系

研究顯示，益生菌對免疫功能的影響與TLRs信號通路密切相關(guān)，TLRs一旦識別并結(jié)合PAMP就會導(dǎo)致下游信號事件和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)激活，從而誘導(dǎo)抗微生物分子、化學(xué)趨化因子、細胞因子和共刺激分子的基因表達，從而引發(fā)天然免疫和獲得性免疫。益生菌可以通過影響TLRs信號通路而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

益生菌可以降低患病機體內(nèi)TLRs基因的表達，同時降低促炎性因子水平，提高抗炎性因子的水平，從而通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，維持機體平衡與健康。Liu等[26]研究表明，在試驗性壞死小腸結(jié)腸炎中，乳酸菌可以下調(diào) IL-6、TNF-α、TLR4和 NF-κB mRNA水平，顯著提高前抗炎因子IL-10的水平。劉翔[27]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌 CMS005治療幽門螺旋桿菌感染小鼠時顯著降低了胃黏膜內(nèi)TLR4、白介素 1β(IL-1β)、TNF-α 和 IL-12 基因的表達，并且 TLR4基因表達量與 IL-1β、TNF-α和IL-12基因表達量呈正相關(guān)。同時劉翔等[28]研究表明，在幽門螺旋桿菌感染的小鼠中益生菌治療組中TLR4、MyD88和IL-1β基因表達量均顯著低于感染組，同時TLR4與MyD88基因表達量呈正相關(guān)。劉偉[29]研究表明，雙歧三聯(lián)活菌可明顯降低三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上模式識別受體TLR2、TLR4及p65 NF-κB基因的表達;并且Peyer氏淋巴(PP)結(jié)免疫細胞產(chǎn)生的促炎癥性細胞因子 TNF-α、干擾素 γ(IFN-γ)和IL-12水平降低，抗炎性細胞因子白介素10(IL-10)水平增加。王學(xué)紅[30]研究表明，益生菌CMSH006菌株下調(diào)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜TLR2，TLR4的基因過量表達，同時抑制IL-1β基因的表達，阻止白介素4(IL-4)基因表達量的下降。Weiss等[31]研究顯示，乳酸菌可以通過TLR受體機制誘導(dǎo)病毒免疫防御基因，乳酸菌可以誘導(dǎo)TLR3、IL-12、IL-10、IFN-β 基因的表達，但在 TLR2基因缺失的DC細胞中，IFN-β產(chǎn)生的量大量減少，該作者提出某些乳酸菌通過依賴IFN-β的TLR2途徑，在DC細胞中引起病毒防御基因的表達。綜上可以看出，益生菌可以通過調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子平衡，下調(diào)TLRs基因的表達來調(diào)節(jié)機體免疫。

益生菌可以通過正常機體內(nèi)TLRs與細胞因子來增強免疫反應(yīng)。Castillo等[32]研究表明，益生菌可以提高健康小鼠體內(nèi)TLR2、TLR4、TLR9基因的表達，同時可以提高 TNF-α、IFN-γ和 IL-10的水平。王艷麗等[33]研究表明，干酪乳酸桿菌可以明顯提高TLR2和甘露醇受體(CD206)陽性細胞數(shù)。鄒明明[34]研究表明，乳酸桿菌DM9811肽聚糖可以促進巨噬細胞表面表達TLR2、TLR4，同時可以促進免疫細胞的增殖分裂，增強某些細胞因子的表達，主要表現(xiàn)為上調(diào)IL-12和TNF-α基因的表達來對先天性免疫反應(yīng)進行調(diào)節(jié)。張琳等[35]研究表明，乳酸桿菌制劑可減輕應(yīng)用抗生素大鼠體內(nèi)TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄受抑程度。Gao等[36]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌激活HT-29細胞中TLR2-My88不依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，用RNA干擾 MyD88分子，對NF-κB、白介素 8(IL-8)、IL-6 和 TNF-α 基因的表達無顯著影響，但是敲除TLR2基因后NF-κB基因的表達量下降，丁酸梭菌可以提高TLR2 mRNA水平，但是MyD88分子水平并未上調(diào)，說明丁酸梭菌通過TLR2基因誘導(dǎo)細胞反應(yīng)。

另外，益生菌及其相關(guān)物質(zhì)可以通過影響免疫細胞來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，Gomez-Llorente等[37]研究表明，益生菌可以調(diào)節(jié)自身免疫耐受反應(yīng)，而DC細胞通過TLR受體來對微生物信號進行應(yīng)答，同時 TLR調(diào)節(jié)信號可以通過誘導(dǎo) CD80、CD83、CD88和CCR7的上調(diào)來控制DC的成熟。Gad等[38]研究表明，益生菌可以通過調(diào)節(jié)DC細胞來調(diào)節(jié)T細胞的分化來產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。

4 小結(jié)

益生菌制劑作為一種很有前景的抗生素替代物受到廣泛的關(guān)注，對于益生菌影響免疫作用的機制已有一定的研究，但大多停留在對細胞因子和免疫球蛋白的影響等方面，對于益生菌對免疫過程細胞信號通路方面的影響方面的研究較少，而TLRs信號通路是免疫過程的重要信號通路，因此有必要對益生菌和TLRs信號通路的關(guān)系進行深入研究，進一步揭示益生菌影響免疫的機制。

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