丁濤 呂辰 袁芳 沈崇鈺 吳斌 費(fèi)曉慶 陳國松 張 睿 張曉燕 陳磊 袁娟 庾金良 李麗

（1江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，南京210001；2南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京211816；3桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，桂林541004）

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定蜂蜜中脯氨酸

丁濤1呂辰2袁芳1沈崇鈺1吳斌1費(fèi)曉慶1陳國松2張 睿1張曉燕1陳磊1袁娟1庾金良2李麗3

（1江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，南京210001；2南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京211816；3桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，桂林541004）

建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定蜂蜜中脯氨酸的方法。蜂蜜樣品用去離子水溶解后，過0.45μm水相微孔濾膜，高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測。以Phenomenex C18（100 mm×4.6mm× 2.6 μm）色譜柱為分析柱，乙腈和0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。通過加標(biāo)驗證，該方法檢測低限可達(dá)25 mg/kg，脯氨酸在0.5～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。在25、50和100 mg/kg三個加標(biāo)水平下，蜂蜜中脯氨酸平均回收率為83.7～109.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4～10.9%。該方法樣品處理簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，可以作為日常蜂蜜中脯氨酸的檢測方法。

脯氨酸；蜂蜜；高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜

蜂蜜中的蛋白質(zhì)來源于蜜蜂和產(chǎn)蜜植物，主要存在于花粉當(dāng)中，在花卉蜜和甘露蜜中的含量分別占1.0～1.5%和3%。氨基酸占蛋白質(zhì)的1%，其中脯氨酸是氨基酸中最主要成分，占50～85%[1]。研究表明，蜂蜜中脯氨酸的含量不僅被作為衡量蜂蜜中游離氨基酸含量的標(biāo)準(zhǔn)，也被作為蜂蜜成熟度和糖摻假的判定標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。

目前，美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）[4]、國際蜂蜜委員會（IHC）[5]等許多國際組織都推薦了蜂蜜中脯氨酸檢測方法。現(xiàn)有脯氨酸的檢測方法主要集中在分光光度法[4-6]和高效液相色譜法[7]。分光光度法前處理需要衍生化，抗干擾能力較弱，難以滿足目前分析檢測的需要，而高效液相色譜法在定性和定量準(zhǔn)確性上大大提高，但由于脯氨酸不具有紫外或熒光特性，仍需要衍生化，檢測通量不能大幅提高。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀結(jié)合了液相色譜和串聯(lián)四極桿質(zhì)譜靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)及檢測效率高等特點，已成為定性和定量分析首選方法。本研究建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定蜂蜜中脯氨酸的方法，該方法靈敏度高、前處理簡便、快速準(zhǔn)確，適合大批量蜂蜜樣品中脯氨酸的檢測及分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國Agilent公司），三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（API 4000-Q，美國AB公司）；ELGA-Q15高純水發(fā)生器（英國ELGA公司）。

脯氨酸（Proline）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）。乙腈、甲酸為色譜純，購自德國Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 ml容量瓶中，用去離子水溶解，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封保存于4℃冰箱中。再準(zhǔn)確吸取1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 ml于10 mL容量瓶中，用去離子水定容得100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用前用初始流動相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取蜂蜜樣品1.0 g于50 ml容量瓶中，加水混合均勻后定容，取適量溶液過0.45 μm的水相濾膜至進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×4.6mm×2.6 μm）；流速：0.25 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5 μl；流動相：A，乙腈；B，0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0～4 min 90-90%B,4～6 min 90-50%B,6～7 min 50%B,7～9 min 50-90%B，9～10min 90-90%B。

1.5 質(zhì)譜條件

掃描方式：電噴霧正離子模式（ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；噴霧電壓：4500 V；去簇電壓：80 V；氣簾氣：69 KPa；碰撞氣：34.5 KPa；去溶劑溫度：500℃；霧化氣：345 KPa；輔助氣：345 KPa；脯氨酸詳細(xì)質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 脯氨酸質(zhì)譜信息表

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 色譜柱和流動相的選擇

本實驗選擇以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相梯度洗脫考察Agilent Carbohydrate柱 (150 mm×4.6 mm×5 μm)、Phenomenex NH2柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和HP Amide（25cm×4.6 mm×2.6 μm）三種分析色譜柱，比較脯氨酸分離和保留效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下，脯氨酸在Carbohydrate柱和HP Amide柱上的保留和色譜峰形均優(yōu)于NH2柱，但同時發(fā)現(xiàn)Carbohydrate柱和HP Amide柱耐用性相對較差，大批量樣品分析后脯氨酸的色譜峰形和保留時間重現(xiàn)性下降，定性和定量準(zhǔn)確性下降。因此，我們嘗試使用耐用性相對較好的碳十八色譜柱Phenomenex C18（100 mm×4.6mm×2.6 μm）作為分析色譜柱。實驗選擇乙腈-水、乙腈-5 mmol/ L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相分析比較脯氨酸保留和峰型效果。結(jié)果表明，流動相中加入適量乙酸銨能夠有助于脯氨酸的色譜保留，但峰型會出現(xiàn)略微拖尾現(xiàn)象。而少量甲酸的加入，脯氨酸保留時間有所提前，但峰形更對稱，同時正離子模式下，加入少量的酸有利于目標(biāo)化合物的離子化，靈敏度可提高10～20%。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用流動注射方式將目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜儀，進(jìn)行全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，質(zhì)譜分析中采用最為常用的電噴霧電離源（ESI）對脯氨酸進(jìn)行去簇電壓、碰撞能量、噴霧氣流量的優(yōu)化，分別選取信號強(qiáng)度最強(qiáng)的兩個離子碎片作為定性和定量離子（見圖1），實際蜂蜜樣品加標(biāo)圖譜見圖2。

圖1 目標(biāo)物準(zhǔn)分子離子的二級碎片離子質(zhì)譜圖

圖2 蜂蜜中添加脯氨酸選擇離子流色譜圖（添加水平25mg/kg）

2.3 方法的線性范圍、回收率、精確度

按1.2制備100 mg/L脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈-水（10∶90，v/v）稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次得到含量為0.5、1、2、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的儀器條件測定，外標(biāo)法定量。以脯氨酸特征離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)、含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.99，表明脯氨酸在0.5～10.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別在江蘇油菜蜜（1）、河南荊條蜜（2）、新疆葵花蜜（3）、寧夏棉花蜜（4）、吉林椴樹蜜（5）、陜西棗花蜜（6）、山東洋槐蜜（7）、內(nèi)蒙蕎麥蜜（8）8種蜂蜜樣品中添加25、50和100 mg/kg 3個不同加標(biāo)水平的脯氨酸，每個水平重復(fù)測定5次?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差范圍見（表2）。

2.4 蜂蜜中脯氨酸檢測方法結(jié)果比對

目前國內(nèi)蜂蜜中脯氨酸檢測常用的方法是SN/T 0850-2000《進(jìn)出口蜂蜜中脯氨酸的測定方法分光光度法》[12]，盡管該標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)作廢，但在沒有新標(biāo)準(zhǔn)檢測方法發(fā)布的情況下，很多檢測機(jī)構(gòu)依然將該方法作為參考檢測方法使用。對所收集的蜂蜜樣品分別用上述方法和本研究方法進(jìn)行比較，每一樣品平行測定 5次（n=5），結(jié)果見表3。結(jié)果表明：本方法所測得結(jié)果都比分光光度方法所測數(shù)值略低，其原因為蜂蜜中除脯氨酸外還含有多種蛋白質(zhì)和其他α-氨基酸，其在酸性條件下都會和茚三酮發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致使用分光光度法測定時結(jié)果偏高。且分光光度法前處理略顯繁瑣，目前已有文獻(xiàn)指出該方法存在實驗環(huán)境溫度、茚三酮顯色劑保存條

表2 8種不同種類蜂蜜樣品中脯氨酸的加標(biāo)回收率和精密度（n=5）

表3 8種不同種類蜂蜜中脯氨酸的含量(n=5)

件、沸水浴發(fā)色時間等等因素的差異均會導(dǎo)致吸光度數(shù)值發(fā)生變化，如不能嚴(yán)格控制以上測定條件會直接影響結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性[8-10]。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜直接測定蜂蜜中脯氨酸含量的檢測方法。樣品經(jīng)去離子水稀釋溶解后直接進(jìn)樣測定，樣品基質(zhì)對目標(biāo)測定物無干擾，避免了傳統(tǒng)分光光度法中復(fù)雜的前處理過程。該方法操作簡單、快速、靈敏度高，能夠滿足蜂蜜中脯氨酸的日常分析要求。

[1]Hermonsin I,Chicon,R M,ea al.Food Chem.2003,83(2): 263-268.

[2]Maria P,Daniel W,Armstrong,Chirality,1994,6(4):270-276.

[3]Bogdanov S,Peter M,Mitt.Lebensm.Hyg.2002,93(7/10): 232-254.

[4]AOACOfficial Method 979.20 Proline in Honey.

[5]Harmonised methods of the international honey commission,International HoneyCommission(2009).

[6]Czipa N,BorbelyM,Gyori Z,Acta Alimentaria.2012,41(1):26-32

[7]蜂蜜中脯氨酸的測定-液相色譜法 國家標(biāo)準(zhǔn)計劃編號20110434-T-422.

[8]薛靜，梁恒，李甜，等.毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法測定人尿中脯氨酸和羥脯氨酸.分析化學(xué),2005,33(6):785-788.

[9]職明星，李秀菊.脯氨酸測定方法的改進(jìn).植物生理學(xué)通訊，2005,41(3):355-357.

[10]吳金鳳，唐丹舟.影響測定蜂蜜中脯氨酸含量的因素.檢驗檢疫科學(xué)，1992，3(2):36-38.

Direct determination of proline in honey by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

DING Tao1，LV Chen2,Yuan Fang1，SHEN Chongyu1，WU Bin1，F(xiàn)EI Xiaoqing1，CHEN Guosong2，ZHANG Rui1，ZHANG Xiaoyan1，Chen Lei1，YUAN Juan1，YU Jinliang2，LI Li3
（1 Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China；2 College of Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，China；3 Department of Chemistry and Biological Engineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for the determination of proline in honey.The honey samples were diluted with deionized water.The separation of analyte was carried out on a Phenomenex C18column（100mm×4.6mm，2.6μm）using mobile phases of acetonitrile-5mmol/l ammonium acetate-0.1% （v/v）formic acid solution with gradient elution.The analysis was carried out by multi-reaction monitoring（MRM）mode with electrospray ionization interface（ESI）in positive mode.The calibration curve was good in the range of 0.5～10 μg/ml（r＞0.99）.The detection limit of the method was 25 mg/kg.The average recoveries were between 83.7%to 109.6%at three spiked levels（25,50 and 100 mg/kg）with the relative standard deviations（RSDs）no more than 10.9%.The method is simple,rapid,and suitable to detect the proline in honey with high throughput.

Proline，Honey，LC-MS/MS

項目資助：質(zhì)檢總局項目2011IK218和2011IK209

丁濤，男，高級工程師，E-mail:dingt@jsciq.gov.cn