羅鴻斌

(東莞理工學(xué)院 科研處，廣東東莞 523808)

近年來(lái)，環(huán)境污染愈演愈烈，已嚴(yán)重影響人們的日常生活和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。如何在經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的同時(shí)，有效地治理環(huán)境，實(shí)現(xiàn)生態(tài)文明，以達(dá)到和諧社會(huì)之目標(biāo)是急需解決的問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是以現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為代表的生物技術(shù)，由于其快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)，在環(huán)保領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文主要綜述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法、核酸分子雜交技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、生物芯片技術(shù)、生物傳感器等6 種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的原理和在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)

1.1 概念及特點(diǎn)

PCR 技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工具，在生物學(xué)研究領(lǐng)域已應(yīng)用成熟，并衍生出諸多不同種類(lèi)，如逆轉(zhuǎn)錄PCR、定量PCR、多重PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR、巢式PCR、嵌套PCR 等。PCR 是DNA 的一種體外擴(kuò)增技術(shù)，在一定的反應(yīng)條件下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA 得以迅速擴(kuò)增，并通過(guò)凝膠電泳、熒光等技術(shù)手段顯現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果。PCR 方法具有快速、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，可以對(duì)環(huán)境的各個(gè)方面進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

PCR 技術(shù)適用于檢測(cè)不能培養(yǎng)的微生物，已逐漸取代了傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，用于土壤、水樣、沉積物等環(huán)境標(biāo)本的檢測(cè)，極大提高監(jiān)測(cè)效率。在實(shí)際檢測(cè)中，不同的微生物病原體具有不同的致病劑量，確定環(huán)境樣品中病原體的數(shù)量和種類(lèi)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度至關(guān)重要。有研究表明，飲用水樣品中只有不到1%的微生物可經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)［1］。PCR 技術(shù)由于靈敏度高，可在濃度很小的情況下檢出病原體，而且比電鏡更加靈敏、簡(jiǎn)便、特異性更高，可以針對(duì)某種或某幾種致病微生物作出檢測(cè)判斷，在水環(huán)境微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。在大氣監(jiān)測(cè)方面，Thomson 用PCR 檢測(cè)暴露在過(guò)量O3和固體顆粒物的空氣環(huán)境中4 h 的人體腦垂體基因表達(dá)情況，從而間接評(píng)估空氣質(zhì)量［2］;陳維田等應(yīng)用PCR 方法對(duì)空調(diào)冷卻塔水與空氣軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間僅需6 小時(shí)到1 個(gè)工作日［3］。

PCR 技術(shù)與變性梯度電泳技術(shù)(DGGE)的結(jié)合，可分離長(zhǎng)度相同但是序列不同的DNA 片斷混合物。陳竹等闡述了PCR－DGGE 技術(shù)在造紙廢水中微生物檢測(cè)的應(yīng)用［4］;楊慶宇等使用PCR－DGGE技術(shù)來(lái)分析生物塔(廢氣從上面進(jìn)入)中的微生物多樣性，可以反映真實(shí)的環(huán)境情況。而傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)大約只能得到環(huán)境中1%的微生物，且微生物經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生變異，不能反映環(huán)境中的真實(shí)情況［5］。

這幾年的研究熱點(diǎn)，熒光定量PCR(FQ－PCR)是通過(guò)在PCR 體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)定量的PCR 檢測(cè)。Brooks 等證明該技術(shù)對(duì)雨季時(shí)海水中的甲肝病毒的檢測(cè)及定量測(cè)定均有很高的精確度。同時(shí)指出該技術(shù)對(duì)于環(huán)境微生物定量測(cè)定的發(fā)展前景［6］。Rebecca 等對(duì)容易引起水傳播疾病的賈第蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)建立了定量分析方法［7］。Frich 等證明實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)水體中嗜肺軍團(tuán)桿菌的結(jié)果與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法一致，但它的檢測(cè)靈敏性和重現(xiàn)性均比傳統(tǒng)方法高［8］。隨著該技術(shù)的不斷成熟，以及和其它分子生物學(xué)技術(shù)配合使用，必將有廣闊的應(yīng)用前景。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)

2.1 概念及特點(diǎn)

LAMP 是近年較為流行的分子生物學(xué)技術(shù)，與以前的PCR 相關(guān)技術(shù)的設(shè)計(jì)思路不同，此方法是針對(duì)靶序列中6 個(gè)基因區(qū)段設(shè)計(jì)2 對(duì)特殊引物，利用Bst DNApolymerase 在延伸DNA 同時(shí)的鏈置換活性，通過(guò)引物獨(dú)特的反轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，對(duì)目的片段進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件(61℃～65 ℃左右)下幾十分鐘即可完成DNA 擴(kuò)增。也可以直接以RNA 為模板擴(kuò)增，加入AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，一步實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，不需要合成cDNA。由于擴(kuò)增反應(yīng)的效率很高，擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度可直觀察判斷。日本榮研公司已利用這種特性研制出濁度儀用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP 反應(yīng)。在終產(chǎn)物中加入熒光染料，直接用肉眼觀察比色。LAMP 方法靈敏度高，反應(yīng)效率高，特異性強(qiáng)，結(jié)果易判定、操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低，適合基層的簡(jiǎn)易環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用。

2.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

可通過(guò)榮研公司建立的官方網(wǎng)站了解和利用LAMP 擴(kuò)增的原理、引物設(shè)計(jì)、LAMP 的研究進(jìn)展。國(guó)內(nèi)眾多研究人員已建立起病原微生物的LAMP 檢測(cè)方法，在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也將越來(lái)越多。楊麗建立了快速高效檢測(cè)水環(huán)境三種典型腸病毒(星狀病毒、輪狀病毒、諾如病毒)的LAMP 檢測(cè)方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化驗(yàn)證該方法的特異性和靈敏度，并應(yīng)用于部分實(shí)際水樣的檢測(cè)，對(duì)于改進(jìn)污水處理工藝有重要作用［9］。有土耳其學(xué)者使用顯微技術(shù)、巢式PCR、LAMP 三種技術(shù)，對(duì)黑海旁O(shè)rdu 省的70 份水樣的隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)，表明LAMP 檢測(cè)效率更高［10］。

3 核酸分子雜交技術(shù)

3.1 概念及特點(diǎn)

核酸分子雜交技術(shù)的基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈，用特異性的探針與待測(cè)樣品的DNA 或RNA 形成雜交分子的過(guò)程。核酸分子雜交技術(shù)主要有以下幾種:Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、芯片雜交。核酸雜交技術(shù)具有其高度特異性、靈敏性、快速等特點(diǎn)。

3.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

核酸分子雜交技可以快速檢測(cè)出環(huán)境微生物中獨(dú)特的核酸序列。如對(duì)活性污泥中的特定微生物的生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)放射性強(qiáng)度可以定量分析特定細(xì)菌的DNA 量。在對(duì)被石油污染的土壤分析中，用核酸雜交法得到某種烴降解基因的檢出率顯著高于不污染樣品，結(jié)果表明，污染越嚴(yán)重，這種降解基因的含量也越高，可用來(lái)評(píng)價(jià)中石油污染程度［11］。

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)是核酸原位雜交技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。該技術(shù)結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性，無(wú)需單獨(dú)分離出DNA 或RNA，通過(guò)激發(fā)雜交探針的熒光來(lái)檢測(cè)信號(hào)從而對(duì)未知的核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可直接在熒光顯微鏡下觀察。Gulnur Coskuner 認(rèn)為FISH 技術(shù)能揭示更多硝化細(xì)菌的微生物學(xué)方面的信息及它們種群的大小，更有利于改進(jìn)生物脫氮系統(tǒng)的工藝，避免了傳統(tǒng)的、用培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)帶來(lái)的偏差［11］。彭永臻等列舉了FISH 在活性污泥細(xì)菌檢測(cè)，高效生物除磷(EBPR)反應(yīng)器微生物群落的測(cè)定、污水處理微生物檢測(cè)等方面的應(yīng)用 。

4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)

4.1 概念及特點(diǎn)

ELISA 是將免疫技術(shù)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合，把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種超微量的測(cè)定技術(shù)，并可以定量檢測(cè)，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用非常廣泛。ELISA 常用的方法主要包括雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等。其核心技術(shù)是抗原抗體的特異性反應(yīng)，酶結(jié)合于相應(yīng)抗原或抗體后，加入的底物會(huì)有顏色反應(yīng)，采用現(xiàn)代光學(xué)分析儀器對(duì)受檢樣品中的酶標(biāo)免疫反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行光度測(cè)定。ELISA 法具有簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、靈敏、特異、高通量等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

4.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

ELISA 在水和土壤的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面取得了很好的效果，已成功應(yīng)用于甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、氟蟲(chóng)腈殺蟲(chóng)劑、除蟲(chóng)脲農(nóng)藥等的檢測(cè)［13］，有些發(fā)達(dá)國(guó)家已開(kāi)發(fā)出商品檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于環(huán)境中的農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析。間接ELISA 方法測(cè)定水產(chǎn)品中甲氰菊酯殘留的最低檢出限為20 Lg·kg－1，接近或達(dá)到氣相色譜法的測(cè)定水平，可在3 h 內(nèi)完成近百個(gè)樣品的分析，極大提高了檢測(cè)效率［14］;此法檢測(cè)稻田土壤中除草劑毒莠定殘留的結(jié)果表明，毒莠定的檢出下限可達(dá)5 Ng·mL－1，樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有干擾;由于間接ELISA 的靈敏性和特異性，也被證實(shí)可用于生防菌殺蟲(chóng)蛋白的監(jiān)測(cè)［15］。

5 生物芯片技術(shù)

5.1 概念及特點(diǎn)

生物芯片是生物學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)高度交叉的新興技術(shù)。本質(zhì)特征是利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理及計(jì)算機(jī)，將生命科學(xué)研究中不連續(xù)的樣品檢測(cè)、分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的連續(xù)化、集成化、微型化。其原理是將大量的核酸片段、多肽分子、組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與標(biāo)記好的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行定性和定量分析。常見(jiàn)的生物芯片主要分為:基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室等。生物芯片具特異性好、高通量、自動(dòng)化、平行性好、簡(jiǎn)便快速、無(wú)污染、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)，在進(jìn)行大批量篩選環(huán)境樣品和對(duì)其進(jìn)行分型研究中有廣泛應(yīng)用。

5.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

生物芯片技術(shù)已成功應(yīng)用到環(huán)境監(jiān)測(cè)中的病原細(xì)菌瞬時(shí)檢測(cè)、細(xì)菌基因表達(dá)水平測(cè)量、菌種鑒定、水質(zhì)控制等方面。RhodeIsland 大學(xué)研究人員將生物傳感器技術(shù)和光纖技術(shù)相結(jié)合，用光纖末端接觸待測(cè)物，開(kāi)發(fā)了一種可即時(shí)、精確檢測(cè)水中沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的生物芯片技術(shù)［16］;法國(guó)一家主要的水管理企業(yè)開(kāi)發(fā)了一種生物芯片，隨時(shí)監(jiān)測(cè)公共飲用水中微生物的變化［16］;Anthony 等利用DNA 芯片建立的細(xì)菌檢測(cè)及鑒定系統(tǒng)，可快速監(jiān)測(cè)細(xì)菌的種類(lèi)和濃度［17］。Wang 等將毛細(xì)管電泳芯片與厚膜電流檢測(cè)器集成在一起，可在140 s 內(nèi)從摻入有機(jī)磷神經(jīng)毒物的河水中分離檢測(cè)出磷、乙基對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷［18］。Backer 等利用基于氧化錫的微反應(yīng)芯片實(shí)現(xiàn)了對(duì)空氣中CO、NO 和NO2氣體的測(cè)量［19］。

6 生物傳感器

6.1 概念及特點(diǎn)

生物傳感器是基于生物反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一類(lèi)化學(xué)傳感器，以酶、微生物、抗原或抗體等具有生物活性的固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件，由信號(hào)轉(zhuǎn)換元件將外界對(duì)其理化性質(zhì)的影響轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并通過(guò)信號(hào)放大裝置放大，而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定量測(cè)定。根據(jù)生物分子識(shí)別的原理，可分為:免疫化學(xué)傳感器、酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、組織傳感器、細(xì)胞傳感器、DNA 傳感器等。生物傳感器與傳統(tǒng)的分析方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn):體積小，可以實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)連續(xù)監(jiān)測(cè);反應(yīng)快，可以反復(fù)多次使用;成本低，便于推廣普及;樣品用量少，一般不需要樣品的預(yù)處理，一般不需加入其他試劑。

6.2 在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

生物傳感技術(shù)可用來(lái)測(cè)定水體中的BOD、酚、NO3、有機(jī)磷，還可以用來(lái)分析大氣中的CO2、SO2、NOx 的含量及濃度等。BOD 生物傳感器可在10 ～15 min 檢測(cè)出BOD 值，可對(duì)水質(zhì)狀況實(shí)行在線(xiàn)監(jiān)測(cè)［20］;白志輝等用硫化物桿菌制成硫化物傳感器，用于對(duì)生活污水、工業(yè)廢水等基體復(fù)雜樣品中的硫化物測(cè)定［21］。

生物傳感器不僅可用來(lái)檢測(cè)水質(zhì)的常規(guī)污染指標(biāo)，還可用于檢測(cè)某種或某一類(lèi)有毒有害污染物，如重金屬、殺蟲(chóng)劑、除草劑等。Andreas 等報(bào)道了將檢測(cè)汞的傳感器菌株用于測(cè)定土壤中汞的生物有效性［22］;Roberto 等利用綠色熒光蛋白(GFP)，研制出一種細(xì)菌熒光素酶生物傳感器，可測(cè)定亞微克水平的亞砷酸鹽和砷酸鹽，對(duì)砷污染地區(qū)能進(jìn)行長(zhǎng)期的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，且效果好、費(fèi)用低［23］。

在大氣污染監(jiān)測(cè)方面。Shiroaki 等使用自養(yǎng)微生物和氧電極的CO2傳感器，傳感器對(duì)濃度在3% ～2%之間的CO2。Suzuki 等人利用半導(dǎo)體技術(shù)研究出一種使用更為方便的CO2生物傳感器［20］;Charles 等用多孔滲透膜、固定化硝化細(xì)菌和氧電極組成微生物傳感器，用此傳感器測(cè)定樣品中的亞硝酸鹽含量，可間接測(cè)定空氣中NOx 的濃度，其檢出限為1x10－8mol·L－1［24］。

7 結(jié)語(yǔ)

除以上介紹的用于環(huán)境監(jiān)測(cè)的分子生物技術(shù)外，還有流式細(xì)胞測(cè)定技術(shù)、凝膠電流技術(shù)、微核技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)等。通過(guò)對(duì)這些方法的闡述，以期讓環(huán)保工作者對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)的方向有進(jìn)一步的了解。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，這些方法在環(huán)境科學(xué)中的地位和作用將更加明顯。廣大生物和環(huán)保工作者可通過(guò)更深入的研究探索，進(jìn)一步的完善和優(yōu)化，并與其它監(jiān)測(cè)手段配合使用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，為環(huán)境監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。

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